污染(ran)是(shi)(shi)細胞培養的(de)(de)大(da)敵。預防和(he)避免污染(ran)是(shi)(shi)細胞培養成功的(de)(de)關鍵之一(yi)。一(yi)開(kai)始就要十分重視，防止(zhi)污染(ran)，否則會前(qian)功盡棄，不(bu)僅浪費(fei)時(shi)間(jian)，而且(qie)浪費(fei)人力(li)、物力(li)，甚至(zhi)造(zao)成無法(fa)彌補的(de)(de)損(sun)失。

　　(一)污染的類型

　　細胞培養過程中的污染不僅僅指微生(sheng)物，而且還包(bao)括(kuo)(kuo)所有混入培養環境中的、對細胞生(sheng)存(cun)有害或造(zao)成細胞不純的物質，包(bao)括(kuo)(kuo)生(sheng)物和(he)化學(xue)物質。

　　1、細(xi)菌污(wu)染

　　細菌(jun)(jun)污(wu)染(ran)是實驗室細胞(bao)培養中常(chang)見(jian)的污(wu)染(ran)，即使在細胞(bao)培養液中加入了(le)抗菌(jun)(jun)素(su)，也可能因為(wei)操作不慎(shen)而引起污(wu)染(ran)。最常(chang)見(jian)的有(you)革蘭氏(shi)陽(yang)性菌(jun)(jun)，如枯(ku)草桿菌(jun)(jun)以及大腸桿菌(jun)(jun)、假單胞(bao)菌(jun)(jun)等革蘭氏(shi)陰(yin)性菌(jun)(jun)，其中又以白色葡萄球(qiu)菌(jun)(jun)較(jiao)常(chang)見(jian)。

　　培養細(xi)(xi)胞受細(xi)(xi)菌污染后，會(hui)出(chu)現培養液變(bian)混濁(zhuo)，pH改(gai)變(bian)。污染后細(xi)(xi)胞發生(sheng)病(bing)理改(gai)變(bian)，胞內顆粒(li)增多、增粗，最(zui)后變(bian)圓脫落死(si)亡。

　　2、真(zhen)菌污(wu)染(ran)

　　真(zhen)菌(jun)污染是(shi)細胞培養過程中最常見的一種，最常見的真(zhen)菌(jun)有煙曲(qu)霉、黑曲(qu)菌(jun)、孔子霉、毛霉菌(jun)、白色念珠菌(jun)和(he)酵母(mu)菌(jun)。

　　培養細胞受真(zhen)菌污染后，可見培養液中漂(piao)浮著白(bai)色或淺黃色的(de)(de)小點(dian)，有的(de)(de)散在(zai)(zai)生(sheng)長，培養液一般不發(fa)生(sheng)混濁;倒(dao)置(zhi)顯微鏡下可見絲狀、管狀或樹枝狀的(de)(de)菌絲縱橫交錯在(zai)(zai)細胞之(zhi)間或培養基中，有的(de)(de)呈鏈狀排(pai)列。

　　真菌污染后(hou)，細胞(bao)生長變慢，但最后(hou)由于(yu)營(ying)養(yang)耗(hao)盡及毒(du)性(xing)作用(yong)而(er)使細胞(bao)脫落死亡。

　　

絲狀菌污染

　　3、支(zhi)原(yuan)體(ti)污(wu)染

　　支原體是介于細(xi)菌與病毒之(zhi)間能(neng)獨(du)立生(sheng)活的最小微生(sheng)物，最小直徑0.2μm，一般(ban)過濾除(chu)菌無法去(qu)除(chu)它，光(guang)鏡下難以看清(qing)它的形態結構。開始不易發(fa)現，能(neng)在(zai)偏堿條件下生(sheng)存，對青霉(mei)素有抗藥性。多吸附于細(xi)胞(bao)(bao)表面或散在(zai)于細(xi)胞(bao)(bao)之(zhi)間。

　　培(pei)養(yang)細(xi)(xi)胞(bao)受(shou)支原體污(wu)(wu)染(ran)后，部分敏感細(xi)(xi)胞(bao)可見細(xi)(xi)胞(bao)生(sheng)長增殖變(bian)慢(man)，部分細(xi)(xi)胞(bao)變(bian)圓，從瓶壁脫落。但多數細(xi)(xi)胞(bao)污(wu)(wu)染(ran)后無明顯變(bian)化(hua)，或略有變(bian)化(hua)，若不及時(shi)處理，還會產生(sheng)交叉污(wu)(wu)染(ran)。

    

陽性                    陰(yin)性

　　4、病(bing)毒污染(ran)

　　組織細胞培養過(guo)程中，如果沒有(you)除去潛在的病(bing)毒(du)，就會產生病(bing)毒(du)污染。目(mu)前(qian)，從原代(dai)猴腎細胞的培養中已發現不少于20種血清性病(bing)毒(du)。

　　盡管病毒污染的細(xi)胞(bao)不(bu)影響原代培養，但生產(chan)(chan)疫苗(miao)是不(bu)安全的。因此(ci)，潛(qian)在(zai)病毒是細(xi)胞(bao)大量生產(chan)(chan)和疫苗(miao)、干擾素等生物制(zhi)品(pin)制(zhi)作中的難題。

　　5、非同種(zhong)細(xi)胞(bao)污染

　　由于細(xi)胞(bao)(bao)培養操作時各細(xi)胞(bao)(bao)株所(suo)需(xu)的(de)器材(cai)和溶(rong)液沒有嚴(yan)格分開，往(wang)往(wang)會使一(yi)種(zhong)細(xi)胞(bao)(bao)被另一(yi)種(zhong)細(xi)胞(bao)(bao)污染。目前，世界(jie)上已有幾十種(zhong)細(xi)胞(bao)(bao)都被HeLa細(xi)胞(bao)(bao)所(suo)污染，致使許多(duo)實驗宣告無效。

　　非(fei)細胞培養物所(suo)造成的化學成分的污染也偶(ou)有(you)(you)發生(sheng)，大(da)多是由(you)于細胞培養所(suo)需物品(pin)清洗消毒(du)不徹底(di)而帶入一(yi)些有(you)(you)毒(du)化學物質所(suo)致。

　　(二)污染的鑒別

　　1、細(xi)菌、真菌污染的檢測

　　(1)肉眼觀察

　　細菌、真菌污染(ran)常在(zai)傳代、換液(ye)、加(jia)樣等(deng)開放性操作(zuo)之后發生(sheng)，而且增生(sheng)迅速，若(ruo)有污染(ran)，在(zai)48小時內可明顯觀(guan)察到，例如培養液(ye)變混濁，或(huo)略加(jia)振蕩有很多(duo)漂浮物漂起。

　　(2)接(jie)種觀察(cha)

　　采用普通(tong)肉湯(tang)接(jie)種或用未加(jia)雙抗藥物的培(pei)養液接(jie)種，也可發現是否有污染。

　　(3)鏡下觀察(cha)

　　在倒置顯(xian)微鏡的高倍鏡下可(ke)見培養液中有大量(liang)圓球(qiu)狀顆粒漂浮，即為細菌(jun)污染。

　　若細(xi)胞之間有絲(si)狀、管狀、樹枝狀或卵形的(de)物(wu)質(zhi)常為真菌污染。

　　2、支原體(ti)污染的檢(jian)測(ce)

　　(1)相差顯微鏡觀察

　　直(zhi)接取少許培(pei)養液(ye)滴在載物(wu)片上(shang)，再蓋上(shang)蓋片觀察，支原體在鏡下呈暗色微小顆粒(li)，多位于(yu)細胞(bao)與(yu)細胞(bao)之間，有時可見類似于(yu)布朗(lang)運(yun)動的表現。應注意(yi)與(yu)細胞(bao)破(po)碎(sui)溢出的內容物(wu)如(ru)線粒(li)體等(deng)相(xiang)區別。

　　(2)熒光染色法(fa)觀察

　　用熒(ying)光(guang)染料Hoechst33258，此染料能(neng)與DNA特異地(di)結合，可使支原體內的DNA著色(se)，熒(ying)光(guang)顯微(wei)鏡下支原體呈(cheng)綠色(se)小點，散(san)在(zai)于細胞周圍或(huo)附于細胞表面(mian)。

　　(3)電鏡檢測

　　若條(tiao)件(jian)許可(ke)，可(ke)用掃描電鏡或透射電鏡觀察。一般(ban)在細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)培養(yang)48～72小時(shi)，細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)接近(jin)匯(hui)合前，用胰酶(mei)消化細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)制成(cheng)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)懸液(ye)后(hou)進(jin)行固定、包(bao)埋、切片后(hou)才能進(jin)行觀察。

　　

支原(yuan)體掃描電鏡圖片(pian)

　　(4)培養(yang)檢(jian)測

　　將細(xi)胞懸(xuan)液(ye)5mL加入(ru)45mL支原體肉湯培(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)基(ji)，培(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)14天(tian)后(hou)觀(guan)察肉湯培(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)有無(wu)霧狀沉淀，然后(hou)取0.5ml加入(ru)已冷卻到50℃的培(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)基(ji)中，再用瓊脂培(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)基(ji)做(zuo)分離培(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)，37℃培(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)3天(tian)觀(guan)察有無(wu)“荷包蛋”菌落(luo)出現。

　　3 、病毒的檢測

　　1) 應用電鏡技術(shu)快速(su)診斷動(dong)物病毒(du)病

　　

冠(guan)狀病毒電鏡圖

　　2) 逆轉錄_聚合酶鏈反(fan)應RT_PCR檢測病毒

　　(三)污染的清除

　　培養細胞一經污(wu)染，多數較難處理(li)。如果污(wu)染細胞價值不大(da)，宜棄(qi)之(zhi);在尋找原(yuan)因后徹(che)底消(xiao)毒操作室，復(fu)蘇或重新購置細胞，再培養。

　　若污染(ran)細胞價值較大(da)，又(you)難于(yu)重新(xin)得到(dao)，可采取以下辦法清除。

　　一、細菌(jun)(jun)和真菌(jun)(jun)的清除

　　1、使用抗(kang)生素(su)

　　抗(kang)生(sheng)素(su)對殺(sha)滅細菌較(jiao)有(you)效(xiao)。聯合用(yong)(yong)(yong)藥(yao)(yao)(yao)比單獨用(yong)(yong)(yong)藥(yao)(yao)(yao)效(xiao)果好。預防用(yong)(yong)(yong)藥(yao)(yao)(yao)比污(wu)染(ran)(ran)(ran)后(hou)再用(yong)(yong)(yong)藥(yao)(yao)(yao)效(xiao)果好。預防用(yong)(yong)(yong)藥(yao)(yao)(yao)一(yi)般用(yong)(yong)(yong)雙抗(kang)生(sheng)素(su)，污(wu)染(ran)(ran)(ran)后(hou)清除用(yong)(yong)(yong)藥(yao)(yao)(yao)需(xu)采(cai)用(yong)(yong)(yong)大于常(chang)用(yong)(yong)(yong)量5～10倍的沖洗法(fa)，于加藥(yao)(yao)(yao)后(hou)作用(yong)(yong)(yong)24～48小時，再換(huan)常(chang)規培養液。此法(fa)在污(wu)染(ran)(ran)(ran)早期有(you)效(xiao)。

　　二、支原(yuan)體的清除(chu)

　　1、用MRA處理

　　用MRA(Mycoplasma Removal Agent)處(chu)理(li)細胞，每4天換一次液,連續處(chu)理(li)15天以確保細胞純潔(jie)健(jian)康，效果好.

　　2、用清(qing)洗純化法清(qing)除支(zhi)原體污染的(de)方(fang)法

　　細(xi)胞營養(yang)馴化(hua)→優質細(xi)胞群的篩(shai)選(xuan)→細(xi)胞清(qing)洗→反復離心洗滌(di)

　　其原(yuan)(yuan)(yuan)理是利用(yong)離心力、細胞、微生(sheng)物質量和懸(xuan)液(ye)的(de)(de)浮力差達到清(qing)除支(zhi)(zhi)原(yuan)(yuan)(yuan)體(ti)(ti)的(de)(de)目(mu)的(de)(de)。由(you)于支(zhi)(zhi)原(yuan)(yuan)(yuan)體(ti)(ti)個體(ti)(ti)小且(qie)除發酵支(zhi)(zhi)原(yuan)(yuan)(yuan)體(ti)(ti)外多為細胞外寄生(sheng),所以(yi)通過反復(fu)洗滌細胞和低(di)速離心換液(ye)使其中潛在(zai)的(de)(de)支(zhi)(zhi)原(yuan)(yuan)(yuan)體(ti)(ti)數量降低(di)至極限。

　　如結(jie)合敏感抗生素的抑殺作(zuo)用，可達到(dao)更好的效(xiao)果。

　　3、藥物輔助加(jia)溫處(chu)理

　　先用(yong)藥物處理后，再將污染的組織培(pei)養物放在41℃培(pei)養18小時(shi)，可(ke)殺死支原體，但對(dui)細胞有不良影響。

　　4、使用支原體特異性血清

　　用5%的兔支(zhi)原(yuan)體(ti)免疫血清可去除支(zhi)原(yuan)體(ti)污染，因特(te)異抗(kang)(kang)體(ti)可抑制(zhi)支(zhi)原(yuan)體(ti)生長(chang)，故(gu)經抗(kang)(kang)血清處理(li)后(hou)11天(tian)即(ji)轉為(wei)(wei)陰性，并(bing)且(qie)5個月后(hou)仍(reng)為(wei)(wei)陰性。但此法比較麻煩，不如用抗(kang)(kang)生素(su)方便、經濟。

　　(四)、污染的預防

　　預(yu)防是防止(zhi)細(xi)胞培養過(guo)程(cheng)中(zhong)發(fa)(fa)生污(wu)染(ran)的最好辦(ban)法(fa)。只有預(yu)防工作做在前(qian)，才(cai)能將發(fa)(fa)生污(wu)染(ran)的可能性降到最小程(cheng)度。

　　一(yi)般(ban)預(yu)防(fang)可(ke)從(cong)以下幾方面著手：

　　1、添(tian)加抗生素

　　2、從物品、用品消毒滅(mie)菌著手

　　細(xi)胞培養所用物品清洗、消毒要徹底，各(ge)種(zhong)溶液滅菌(jun)(jun)除菌(jun)(jun)要仔細(xi)，并在無菌(jun)(jun)試驗陰性后才能使用。

　　操作室(shi)及剩余的無菌器材要(yao)定期清(qing)潔消毒(du)滅菌。

　　3、從(cong)操作者做起

　　(1)進無菌室前要(yao)(yao)用(yong)肥皂洗(xi)手(shou)，按規定(ding)穿隔離衣(yi)。工作開始要(yao)(yao)先用(yong)75%酒精棉球擦手(shou)、擦瓶(ping)口(kou)(kou)和(he)燒(shao)灼(zhuo)瓶(ping)口(kou)(kou)。

　　(2)操作(zuo)(zuo)者動(dong)作(zuo)(zuo)要輕，必須在火焰周圍無菌區內打(da)開(kai)瓶口，并將瓶口轉動(dong)燒灼。操作(zuo)(zuo)時盡量不要談(tan)話，若打(da)噴嚏或咳嗽應(ying)轉向背面。

　　(3)操作時要常更換吸(xi)管，一(yi)旦發現吸(xi)管口接觸(chu)了手和(he)其他污染(ran)物品應棄去。實驗完畢用消(xiao)毒水(shui)浸泡(pao)的紗(sha)布擦臺(tai)面(mian)。

　　4、防止細胞交叉污染

　　在進行(xing)多種(zhong)細胞培養操(cao)作時(shi)，所用器具要嚴格(ge)區(qu)分。

　　在進行換液(ye)或(huo)傳代操作時，注(zhu)射器和滴管不要觸及細(xi)胞培養瓶(ping)瓶(ping)口(kou)，以免把細(xi)胞帶(dai)到培養液(ye)中污染其他細(xi)胞。

　　細胞(bao)一旦(dan)購置(zhi)或從別處(chu)引入，均應及早(zao)留種(zhong)凍存，一旦(dan)發生污染(ran)可(ke)重(zhong)新復蘇培養。

　　5、無菌(jun)室的徹底(di)消毒

　　1) 0.1%新潔(jie)爾滅全(quan)面徹(che)底擦洗無菌室;

　　2)甲(jia)醛熏蒸(zheng)法：甲(jia)醛是一(yi)種(zhong)廣(guang)譜滅菌(jun)(jun)(jun)劑菌(jun)(jun)(jun)，其(qi)水溶液和氣休對(dui)各(ge)種(zhong)細菌(jun)(jun)(jun)、芽孢及真菌(jun)(jun)(jun)等微生物均有殺滅作用。