與化學仿制藥(yao)相比，生物類似(si)藥雖然(ran)也屬于仿制(zhi)藥(yao)范疇，但其(qi)不僅投資門檻更高，技(ji)術(shu)門檻也更高。

　　三(san)大技術門檻

　　生物類似藥的技術門檻高至少表(biao)現在三大方面：

　　一是有關生(sheng)產(chan)、制造過(guo)程(cheng)(cheng)和(he)(he)工藝流(liu)程(cheng)(cheng)。在產(chan)品生(sheng)產(chan)過(guo)程(cheng)(cheng)中，有多種因素可能會影響到生(sheng)物(wu)類(lei)似(si)藥(yao)的質量，如(ru)分子(zi)設(she)計(ji)、表達系(xi)統、細胞株類(lei)型、翻譯(yi)后修(xiu)飾(PTM)、不(bu)純物(wu)和(he)(he)污染物(wu)、配方和(he)(he)輔料、包裝容器、生(sheng)產(chan)過(guo)程(cheng)(cheng)中的蛋白降解等(deng)。

　　二是對生(sheng)物(wu)類似(si)藥(yao)(yao)在(zai)(zai)質(zhi)量、安全性(xing)(xing)和有效(xiao)性(xing)(xing)(QSE)等方(fang)面(mian)進行分(fen)析檢(jian)測、表(biao)征，需(xu)要(yao)(yao)在(zai)(zai)臨床試(shi)驗前在(zai)(zai)蛋白的(de)(de)多種性(xing)(xing)質(zhi)上與原(yuan)研藥(yao)(yao)參考品(pin)一致(zhi)。這種一致(zhi)性(xing)(xing)，根據歐(ou)盟EMA的(de)(de)要(yao)(yao)求需(xu)要(yao)(yao)“相似(si)”(similar)。而根據美國FDA的(de)(de)要(yao)(yao)求則需(xu)要(yao)(yao)“高(gao)度相似(si)”(highly similar)。如果是可以自動替(ti)換(interchangeable)的(de)(de)生(sheng)物(wu)類似(si)藥(yao)(yao)，其要(yao)(yao)求更高(gao)。

　　上(shang)面兩大高(gao)門檻對(dui)于中國藥企(qi)而言更是意味著投資的(de)高(gao)門檻，因為無(wu)論是上(shang)下游(you)的(de)工藝(yi)開(kai)發、生產(chan)還是分析方法開(kai)發、質量檢測，所需儀(yi)器設備甚至耗材幾乎都需要進口。

　　第三個(ge)方面是(shi)生物原研(yan)藥(yao)的(de)(de)專利(li)(li)壁壘。生物藥(yao)的(de)(de)專利(li)(li)要遠比化學藥(yao)復雜，這個(ge)高門檻很(hen)容易被(bei)投資人忽視。艾伯維(Abbvie)和(he)安進(jin)(Amgen)因(yin)Humira(修美樂)的(de)(de)生物類似藥(yao)的(de)(de)專利(li)(li)之戰(zhan)僅(jin)僅(jin)是(shi)一(yi)個(ge)例子。現在風(feng)頭正勁的(de)(de)免疫(yi)腫瘤抗(kang)體藥(yao)(尤其是(shi)已(yi)經上市的(de)(de)兩(liang)個(ge)PD-1抗(kang)體藥(yao))以(yi)后很(hen)可(ke)能成為(wei)被(bei)仿制的(de)(de)熱點目(mu)標，但免疫(yi)腫瘤領域近期多起(qi)專利(li)(li)訴訟也(ye)說明：即使是(shi)做原研(yan)生物藥(yao)，專利(li)(li)問題也(ye)需(xu)要防范。

　　出于工作關系和(he)個人興趣，筆(bi)(bi)者(zhe)(zhe)本文(wen)僅(jin)談談生(sheng)物(wu)(wu)類似(si)(si)藥(yao)的(de)分(fen)析技(ji)術。如(ru)表(biao)格所示，生(sheng)物(wu)(wu)類似(si)(si)藥(yao)的(de)表(biao)征分(fen)析，涉及許多生(sheng)物(wu)(wu)化學和(he)生(sheng)物(wu)(wu)物(wu)(wu)理技(ji)術，筆(bi)(bi)者(zhe)(zhe)對于大多數技(ji)術略(lve)知一二，本文(wen)無意具體(ti)談這(zhe)些分(fen)析技(ji)術的(de)細(xi)節(jie)和(he)難(nan)度，而只(zhi)是通過(guo)簡單評論這(zhe)些技(ji)術手段(duan)，試圖說明進入生(sheng)物(wu)(wu)類似(si)(si)藥(yao)的(de)門檻很高。

　　質(zhi)控(kong)蛋(dan)白三(san)大性質(zhi)

　　與評(ping)價(jia)化學藥類似(si)，對(dui)于生物藥的(de)評(ping)價(jia)，質量、安全性(xing)和有(you)效性(xing)可以說是(shi)最重要的(de)三個(ge)方(fang)面，而質量又(you)是(shi)安全性(xing)和有(you)效性(xing)的(de)前提和基(ji)礎。

　　對(dui)于生物(wu)藥的質(zhi)量，FDA認為治療性蛋(dan)白的三大(da)方面性質(zhi)雖(sui)然不(bu)能被完全充分(fen)測定，但對(dui)于評價蛋(dan)白藥是非常重要的，這(zhe)三大(da)性質(zhi)即：PTM、蛋(dan)白高(gao)級結構和(he)蛋(dan)白聚集，下面將分(fen)別簡單介紹。

　　蛋白(bai)的翻(fan)譯后修飾(PTM)

　　蛋白(bai)的(de)(de)(de)翻(fan)譯后(hou)修飾(PTM)有很多種，常見(jian)的(de)(de)(de)包括糖(tang)基(ji)化(hua)(hua)(hua)(又(you)可(ke)細(xi)分(fen)為(wei)：半乳(ru)糖(tang)苷(gan)基(ji)化(hua)(hua)(hua)、巖藻糖(tang)基(ji)化(hua)(hua)(hua)、唾(tuo)液酸糖(tang)苷(gan)化(hua)(hua)(hua)等)、氧化(hua)(hua)(hua)、磷酸化(hua)(hua)(hua)、硫酸化(hua)(hua)(hua)、脂化(hua)(hua)(hua)、二硫鍵形成(cheng)和脫(tuo)酰胺。這些化(hua)(hua)(hua)學變化(hua)(hua)(hua)大多是在(zai)細(xi)胞內發(fa)生的(de)(de)(de)，但有些也可(ke)能發(fa)生在(zai)生產的(de)(de)(de)各(ge)個階段(如純化(hua)(hua)(hua)和儲存過程)。

　　現在的科(ke)學研究已經表明，蛋白(bai)的PTM會影(ying)響蛋白(bai)的活性(xing)和(he)免疫(yi)原性(xing)。蛋白(bai)的PTM還可能改變蛋白(bai)的結構進而引起聚集，從而進一(yi)步影(ying)響蛋白(bai)的免疫(yi)原性(xing)。

　　因此，需(xu)要(yao)在蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)類藥物(wu)生產(chan)的(de)各個(ge)階(jie)段對(dui)(dui)蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)質(zhi)的(de)PTM進行(xing)檢(jian)測。對(dui)(dui)于(yu)單一成分(fen)的(de)純化蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)藥，PTM的(de)檢(jian)測和監測則(ze)相對(dui)(dui)容易一些(xie)。而(er)對(dui)(dui)于(yu)含有(you)(you)許多(duo)種蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)質(zhi)的(de)復雜混合物(wu)蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)藥物(wu)(如有(you)(you)些(xie)預防性疫苗(miao))，即使是采用蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)質(zhi)組學(xue)技術，檢(jian)測所(suo)有(you)(you)蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)的(de)PTM也是非(fei)常大的(de)挑(tiao)戰。

　　研究蛋白PTM的(de)最有力(li)的(de)利器(qi)當是(shi)生(sheng)物(wu)質(zhi)(zhi)譜(pu)了(le)，主要是(shi)基(ji)于(yu)電噴霧(wu)(ESI)和基(ji)質(zhi)(zhi)輔(fu)助激光(guang)解離(MALDI)兩種(zhong)技術。近(jin)年(nian)來，質(zhi)(zhi)譜(pu)在生(sheng)物(wu)類似(si)藥領域的(de)應用(yong)明顯增多，在近(jin)幾年(nian)的(de)美國(guo)質(zhi)(zhi)譜(pu)協會(hui)會(hui)議上(shang)，每年(nian)都(dou)有不少口(kou)頭報(bao)告或墻報(bao)是(shi)直接用(yong)質(zhi)(zhi)譜(pu)研究生(sheng)物(wu)類似(si)藥PTM的(de)，其中糖基(ji)化研究占比最大(da)。

　　但(dan)是，由于(yu)生(sheng)(sheng)物質譜(pu)價格昂貴，動輒幾(ji)十萬(wan)美(mei)元，高端的(de)售價甚至(zhi)在50萬(wan)美(mei)元以上，這也限(xian)制了(le)生(sheng)(sheng)物質譜(pu)在包括(kuo)生(sheng)(sheng)物類(lei)似藥在內的(de)生(sheng)(sheng)物制藥領(ling)域的(de)應用(yong)。

　　蛋白(bai)的高級結構

　　蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)的高(gao)級結(jie)構(gou)是指(zhi)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)的二(er)級、三(san)級和四級結(jie)構(gou)，這些結(jie)構(gou)特性(xing)決(jue)定了蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)的三(san)維空間結(jie)構(gou)，進(jin)而(er)最終決(jue)定了蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)的功能和活性(xing)。因此，比較(jiao)生物(wu)類似藥(指(zhi)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)藥)和原(yuan)研藥的蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)高(gao)級結(jie)構(gou)，是證明兩只藥相似的重要手段。

　　X-射線衍射和核磁共(gong)振(NMR)是(shi)公(gong)認的測定蛋白質三(san)維空(kong)間結構的兩(liang)種(zhong)最主要的技術。但(dan)是(shi)，對(dui)于生物(wu)類似(si)藥(yao)和原研藥(yao)的結構相(xiang)似(si)性研究，這兩(liang)種(zhong)技術都(dou)有很大的挑戰。

　　對于X-射線衍射而言，需要耗時(shi)較(jiao)長(chang)(chang)的蛋白(bai)結晶(jing)過程和(he)數(shu)據(ju)解析(xi)過程，對于樣(yang)品量(liang)較(jiao)大(da)的工業界(jie)而言，顯然不(bu)能滿足高通量(liang)的要求。而NMR不(bu)但價格(ge)昂貴、靈敏度相對較(jiao)低、數(shu)據(ju)分(fen)析(xi)耗時(shi)長(chang)(chang)，對于分(fen)析(xi)分(fen)子(zi)量(liang)達150kDa的大(da)分(fen)子(zi)抗體(ti)藥也面臨很大(da)的挑(tiao)戰，所(suo)以NMR在生物類(lei)似藥領域注定應用非常有(you)限。

　　另(ling)外，還有(you)其(qi)它一(yi)(yi)些經典(dian)生(sheng)物(wu)(wu)物(wu)(wu)理(li)技(ji)術被(bei)用于表(biao)征(zheng)蛋(dan)白(bai)的(de)(de)(de)結(jie)構(gou)，如圓(yuan)二(er)色(se)性譜(pu)(pu)、傅里(li)葉變換紅外光譜(pu)(pu)、熒光光譜(pu)(pu)、差示掃描(miao)量熱法(fa)、分(fen)析超速(su)離(li)心、排阻(zu)色(se)譜(pu)(pu)以及各種(zhong)染料結(jie)合鑒別(bie)技(ji)術等。這(zhe)些技(ji)術一(yi)(yi)個(ge)最主要(yao)的(de)(de)(de)限(xian)制，就是只能(neng)(neng)檢測來自蛋(dan)白(bai)不(bu)同部位的(de)(de)(de)某一(yi)(yi)種(zhong)總的(de)(de)(de)信(xin)號。從這(zhe)些測定得到(dao)(dao)的(de)(de)(de)信(xin)息只能(neng)(neng)得到(dao)(dao)生(sheng)物(wu)(wu)藥(yao)整個(ge)結(jie)構(gou)的(de)(de)(de)總的(de)(de)(de)平均值。比如：圓(yuan)二(er)色(se)性譜(pu)(pu)測定就只能(neng)(neng)表(biao)明某一(yi)(yi)種(zhong)主要(yao)的(de)(de)(de)二(er)級(ji)結(jie)構(gou)(阿(a)(a)爾(er)法(fa)螺(luo)旋、b折疊(die)和(he)無(wu)規卷曲(qu))的(de)(de)(de)平均百分(fen)比。如果一(yi)(yi)個(ge)含有(you)多(duo)個(ge)阿(a)(a)爾(er)法(fa)螺(luo)旋結(jie)構(gou)的(de)(de)(de)蛋(dan)白(bai)，其(qi)中只有(you)一(yi)(yi)個(ge)阿(a)(a)爾(er)法(fa)螺(luo)旋結(jie)構(gou)和(he)另(ling)一(yi)(yi)蛋(dan)白(bai)相比發生(sheng)了變化，但是即使這(zhe)一(yi)(yi)變化相對(dui)較大，被(bei)另(ling)外不(bu)變的(de)(de)(de)阿(a)(a)爾(er)法(fa)螺(luo)旋平均以后，圓(yuan)二(er)色(se)性譜(pu)(pu)所(suo)能(neng)(neng)測到(dao)(dao)的(de)(de)(de)變化也可(ke)能(neng)(neng)很小，甚至沒有(you)可(ke)以測量出(chu)的(de)(de)(de)變化。所(suo)以這(zhe)些經典(dian)生(sheng)物(wu)(wu)物(wu)(wu)理(li)技(ji)術不(bu)能(neng)(neng)用于檢測生(sheng)物(wu)(wu)藥(yao)很小的(de)(de)(de)結(jie)構(gou)變化。

　　更靈敏的(de)(de)技術則是氫氘交(jiao)換質譜(HDX-MS)，這也進一步(bu)顯(xian)示質譜技術在(zai)比較生(sheng)(sheng)物(wu)類似藥和原研藥結(jie)構(gou)方(fang)面的(de)(de)重(zhong)要性。現代(dai)生(sheng)(sheng)物(wu)質譜技術在(zai)生(sheng)(sheng)物(wu)藥領域的(de)(de)應用已(yi)經遠不僅(jin)僅(jin)是做蛋(dan)白(bai)質鑒(jian)定(ding)、分子(zi)量測定(ding)、氨基酸序列測定(ding)，蛋(dan)白(bai)結(jie)構(gou)只是其多(duo)種新應用的(de)(de)一個(ge)方(fang)面。

　　蛋(dan)白聚集

　　蛋(dan)白(bai)(bai)聚集(ji)(ji)是(shi)蛋(dan)白(bai)(bai)藥生產過程中很頭疼的(de)(de)(de)(de)問題(ti)，尤(you)其是(shi)對于高濃度的(de)(de)(de)(de)蛋(dan)白(bai)(bai)溶液，很容易引起蛋(dan)白(bai)(bai)聚集(ji)(ji)。單體(ti)蛋(dan)白(bai)(bai)的(de)(de)(de)(de)聚集(ji)(ji)過程可(ke)以是(shi)可(ke)逆的(de)(de)(de)(de)，也可(ke)能(neng)是(shi)不可(ke)逆的(de)(de)(de)(de)，其聚集(ji)(ji)后的(de)(de)(de)(de)大小可(ke)以從二聚體(ti)到(dao)包(bao)含(han)上萬億個蛋(dan)白(bai)(bai)單體(ti)的(de)(de)(de)(de)肉眼可(ke)見的(de)(de)(de)(de)顆粒。

　　總(zong)的(de)(de)來說，蛋(dan)(dan)(dan)白聚(ju)集(ji)對于任何(he)蛋(dan)(dan)(dan)白藥都是問(wen)題(ti)。蛋(dan)(dan)(dan)白聚(ju)集(ji)不但會(hui)降低蛋(dan)(dan)(dan)白藥的(de)(de)有效劑量(liang)，更大的(de)(de)問(wen)題(ti)是可能會(hui)引起毒副作(zuo)用(yong)和(he)免疫反應。一(yi)般而(er)言(yan)，蛋(dan)(dan)(dan)白分子量(liang)越大，其免疫原性(xing)越強(qiang)。在某些特殊情況(kuang)下，這些難(nan)以預料(liao)的(de)(de)副作(zuo)用(yong)甚至可能是致命的(de)(de)。

　　因此，蛋(dan)白聚集必須被檢測、定(ding)量和表征(zheng)，用以比較生物(wu)類(lei)似(si)藥和原(yuan)研藥。如表中所示，表征(zheng)蛋(dan)白聚集的主要分(fen)析技術包(bao)括排阻-高(gao)效(xiao)(壓)液相色譜(SEC-HPLC)、凝膠電泳、分(fen)析超(chao)速離心、光散射法等。

　　由于(yu)簡(jian)單、易用、廉價(jia)、快速、樣品用量少等(deng)特點(dian)，SEC-HPLC是目前(qian)檢(jian)測蛋白(bai)(bai)聚集(ji)的最(zui)常用方法。當(dang)然(ran)，SEC-HPLC也有自己(ji)的缺(que)點(dian)，如較大的蛋白(bai)(bai)聚體(ti)可能在(zai)進樣上柱時就(jiu)被除去，造成假(jia)陰(yin)性。

　　這也進一(yi)步說明，沒有任(ren)何一(yi)種十全十美的(de)分析技術。正是緣(yuan)于此，美國(guo)FDA和ICH(國(guo)際人用(yong)藥注冊(ce)技術協(xie)調會議)都(dou)建(jian)議生物(wu)類似藥研發企業不但要檢測蛋白不同種性(xing)質，也建(jian)議采(cai)用(yong)多種技術檢測同一(yi)種性(xing)質，以盡量得到更全面的(de)生物(wu)類似藥和原研藥可以比較的(de)多種信息，如(ru)理化性(xing)質、生物(wu)活性(xing)、免疫(yi)化學性(xing)質、純(chun)(chun)度、不純(chun)(chun)物(wu)和污染物(wu)等。

　　相(xiang)似度界定：Case By Case?

　　值得一提的是(shi)，生物類似(si)藥有兩(liang)個常(chang)用且易于混淆的概念：可比(bi)性(comparability)和相(xiang)似(si)性(similarity)。

　　ICH明(ming)確定(ding)義和限制(zhi)“可(ke)比(bi)性(xing)(xing)”是(shi)指(zhi)同(tong)(tong)一(yi)家生(sheng)(sheng)(sheng)產(chan)(chan)商(shang)所生(sheng)(sheng)(sheng)產(chan)(chan)的原(yuan)研(yan)藥(yao)(包括批準上市后(hou)階段)，在(zai)生(sheng)(sheng)(sheng)產(chan)(chan)工藝變(bian)化(如放大)后(hou)，兩(liang)種(zhong)工藝所生(sheng)(sheng)(sheng)產(chan)(chan)的同(tong)(tong)一(yi)產(chan)(chan)品(pin)(pin)(當然不(bu)可(ke)能100%相同(tong)(tong))的可(ke)比(bi)性(xing)(xing)(參見ICH Q5E指(zhi)導(dao)性(xing)(xing)文(wen)件(jian)：Comparability of Biotechnological/Biological Products Subject to Changes in their Manufacturing Process，生(sheng)(sheng)(sheng)產(chan)(chan)過(guo)程變(bian)化后(hou)生(sheng)(sheng)(sheng)物工程/生(sheng)(sheng)(sheng)物產(chan)(chan)品(pin)(pin)的可(ke)比(bi)性(xing)(xing))。而(er)“相似(si)性(xing)(xing)”則(ze)是(shi)生(sheng)(sheng)(sheng)物類似(si)藥(yao)生(sheng)(sheng)(sheng)產(chan)(chan)商(shang)仿制(zhi)的生(sheng)(sheng)(sheng)物藥(yao)與(yu)原(yuan)研(yan)藥(yao)生(sheng)(sheng)(sheng)產(chan)(chan)商(shang)制(zhi)造的參考(kao)品(pin)(pin)相比(bi)較而(er)言(yan)的。

　　根據ICH的定(ding)義，“可比(bi)性”概念(nian)是(shi)不(bu)可用于生(sheng)物類似藥的。但事實上，“可比(bi)性”和“?