01檢驗(yan)方法驗(yan)證的基本內容

　　檢(jian)(jian)驗方(fang)法驗證(zheng)的基本內容包括方(fang)案的起草(cao)及(ji)審批，檢(jian)(jian)測儀器的確(que)認。

　　適用性驗證(包括準確(que)度(du)(du)試(shi)(shi)驗、精密度(du)(du)測定、線性范圍試(shi)(shi)驗、專屬(shu)性試(shi)(shi)驗等(deng))和結(jie)果評(ping)價及(ji)批準四(si)個(ge)的方面。

　　02檢驗方(fang)法驗證的基(ji)本(ben)步驟(zou)

　　首先是(shi)制定(ding)驗(yan)證(zheng)方案，然后對大型精密儀(yi)器進行確認(ren)，最關鍵(jian)的一步是(shi)檢驗(yan)方法的適用性試(shi)驗(yan)，最后是(shi)檢驗(yan)方法評價及批準。

　　1、驗證方案的制定

　　檢(jian)驗方(fang)法的(de)驗證方(fang)案通常(chang)由質量驗證小組提出(chu)。根據產品的(de)工藝(yi)條(tiao)件、原輔料化(hua)學結構、中間體(ti)、分(fen)解產物查閱(yue)有關資料，提出(chu)規(gui)格標準(zhun)，確定檢(jian)查項目，規(gui)定雜質限度，即(ji)為質量標準(zhun)草(cao)案。

　　根據質量標準草案確定檢查(cha)和試驗范圍(wei)，對檢驗方法擬定具體操作步驟，最(zui)后經有關人員審批(pi)方可實施。

　　2、大型精密儀器的確認

　　分析測試中所用的(de)檢測儀器一般可分為三類(lei)：

　　A、普通儀器：崩解儀，折光儀、分析(xi)天(tian)平(ping)、酸度計、溶(rong)點測定儀、電導儀等;

　　B、較精密儀(yi)(yi)器：旋光(guang)儀(yi)(yi)、永停滴(di)定(ding)儀(yi)(yi)、費(fei)休氏水分測定(ding)儀(yi)(yi)、 自動滴(di)定(ding)儀(yi)(yi)、藥物溶出度儀(yi)(yi)、可見分光(guang)光(guang)度計、電泳儀(yi)(yi)等;

　　C、大型精密儀(yi)器：紫外(wai)分光(guang)光(guang)度計、紅外(wai)分光(guang)光(guang)度計、氣相色譜儀(yi)、高(gao)效液相色譜儀(yi)、薄層掃描儀(yi)等。

　　為了保證分析測試數據準確可靠，每臺檢測儀(yi)器在投入正式使用之前都應(ying)進行確認。

　　檢測儀器的(de)確認是檢驗(yan)(yan)方法驗(yan)(yan)證的(de)基礎，應在其它(ta)驗(yan)(yan)證試驗(yan)(yan)開始之前首先(xian)完成。

　　檢(jian)測儀器確認工作內容應根據儀器類型(xing)。技(ji)術(shu)性(xing)能而定，通常包(bao)括：安裝確認、校正、適用(yong)性(xing)預試驗和再確認。

　　3、校正

　　校(xiao)正(zheng)是儀器確認(ren)及檢驗(yan)方法驗(yan)證中的一(yi)個(ge)重(zhong)要環節，應當(dang)在驗(yan)證試驗(yan)以(yi)前進行校(xiao)正(zheng)。紫外(wai)分光光度計校(xiao)正(zheng)包括(kuo)波(bo)長校(xiao)正(zheng)、吸收度測試、準確度測試、雜散光檢查。

　　氣相色譜儀與高(gao)效液相色譜儀均(jun)要求做(zuo)系(xi)統適(shi)用性試(shi)驗(yan)。在規定的色譜條件下(xia)測(ce)定色譜柱(zhu)的最(zui)小理論塔板數。分離度(du)和拖尾因子，并規定變異系(xi)數應不大于2%。

　　對于(yu)化學檢(jian)驗中使用的計量(liang)儀器(qi)包括容量(liang)瓶、移液管、滴定管、分析天平亦均應校(xiao)正(zheng)。

　　4、適用性預試驗

　　儀(yi)器的安裝確(que)(que)認完成以后，在其(qi)功能試驗符合(he)要求的情況下，應用(yong)標(biao)準(zhun)品(pin)或對照品(pin)對其(qi)進行適用(yong)性檢(jian)查，以確(que)(que)認儀(yi)器是(shi)否符合(he)使用(yong)要求。

　　例如對熔(rong)點(dian)測(ce)定儀的(de)適用性預試(shi)(shi)驗是采用已(yi)知溶點(dian)的(de)甲硝唑做試(shi)(shi)驗，測(ce)試(shi)(shi)結(jie)果與已(yi)知熔(rong)點(dian)比(bi)較(jiao)。

　　紫外(wai)分光(guang)光(guang)度計可用已知(zhi)(zhi)含量的(de)某(mou)標準品試驗，測得結果(guo)與已知(zhi)(zhi)數值對比，確定儀器是否符合使用要求。

　　在完(wan)成上(shang)述各項試驗工作的(de)同時(shi)，應(ying)做好相應(ying)的(de)文(wen)件記錄等(deng)資(zi)料(liao)歸檔工作，每一臺儀器均應(ying)有一套完(wan)整(zheng)的(de)檔案資(zi)料(liao)。

　　5、再確認

　　為(wei)了確(que)保儀(yi)器(qi)處于良好的(de)使用(yong)狀態(tai)，對(dui)于一臺(tai)新購買的(de)儀(yi)器(qi)在確(que)認(ren)工作結束以后(hou)，應(ying)根據儀(yi)器(qi)的(de)類別。確(que)認(ren)的(de)經驗制定再確(que)認(ren)的(de)計劃(hua)。

　　再(zai)確認的(de)時間(jian)間(jian)隔和內容要根據儀器類別和使用情(qing)況決定，一(yi)般是3個月、6個月或1年(nian)。

　　儀(yi)器再(zai)確(que)認的內容通常(chang)包括線路連接、附件備品消耗檢查、清潔工(gong)作、功(gong)能試驗、工(gong)作日記等，其中重(zhong)點安裝確(que)認中的功(gong)能試驗。

　　03檢驗方法的適用(yong)性驗證

　　藥品質量標準分(fen)析方法(fa)驗證的(de)目的(de)是證明(ming)采用的(de)方法(fa)適合(he)于(yu)相應(ying)的(de)檢(jian)測要(yao)求。

　　在起草藥品質量標準(zhun)時，分析方(fang)法需(xu)經驗(yan)證(zheng)：在藥物生產方(fang)法變(bian)更、制劑的(de)組分變(bian)更、原分析方(fang)法進行修訂時，則質量標準(zhun)分析方(fang)法也需(xu)進行驗(yan)證(zheng)。

　　方法驗證過程(cheng)和結果(guo)均應記載在藥品(pin)標準起草或修訂(ding)說明中。

　　根據《中國藥典》 (2010版)附錄(lu)XIXA的(de)原(yuan)則要求(qiu)，檢驗方法的(de)驗證可分為三種情況(kuang)處理;

　　1、無需驗證的方(fang)法。如(ru)藥(yao)典(包(bao)括USP、EP、CP、JP等(deng)各國藥(yao)典)的方(fang)法，一般只做系(xi)統適用性(xing)試驗，以確認系(xi)統是否(fou)符合要(yao)(yao)求(主要(yao)(yao)指儀器穩定性(xing)及(ji)柱的分離度是否(fou)達標)。

　　2、對(dui)比(bi)法(fa)。已在參比(bi)實驗(yan)室(shi)(shi)驗(yan)證(zheng)過的分析方(fang)(fang)(fang)法(fa)，可用對(dui)比(bi)試(shi)驗(yan)的方(fang)(fang)(fang)法(fa)來確認(ren)方(fang)(fang)(fang)法(fa)的可靠性(xing)(xing)，即將本實驗(yan)室(shi)(shi)與參比(bi)實驗(yan)室(shi)(shi)用同(tong)一方(fang)(fang)(fang)法(fa)對(dui)同(tong)批樣品所測(ce)數(shu)據進行比(bi)較(如(ru)至少取(qu)五(wu)個批號，每批重(zhong)復測(ce)定五(wu)次)，判斷(duan)方(fang)(fang)(fang)法(fa)在本實驗(yan)室(shi)(shi)的可行性(xing)(xing)。如(ru)有差異需查(cha)明原因(yin)或設計(ji)方(fang)(fang)(fang)案，對(dui)方(fang)(fang)(fang)法(fa)進行再驗(yan)證(zheng)。

　　3、需進行系(xi)統驗證的方法。

　　04檢驗方法的評(ping)價及批準(zhun)

　　安裝確認及適用性試驗(yan)結(jie)束后，應將(jiang)試驗(yan)數據資料(liao)進(jin)行匯(hui)總分(fen)析。對檢驗(yan)方法作(zuo)出正(zheng)確的評價，驗(yan)證(zheng)報告的說明(ming)及結(jie)論部分(fen)應簡(jian)明(ming)扼(e)要。

　　試驗(yan)(yan)中的(de)(de)主(zhu)要偏差應有適當解釋。然(ran)后，報主(zhu)管領(ling)導(dao)審批(pi)。檢驗(yan)(yan)方法驗(yan)(yan)證(zheng)(zheng)的(de)(de)最終產物是一個(ge)經過驗(yan)(yan)證(zheng)(zheng)的(de)(de)方法—根(gen)據(ju)驗(yan)(yan)證(zheng)(zheng)的(de)(de)結果制訂的(de)(de)由有關領(ling)導(dao)批(pi)準的(de)(de)檢驗(yan)(yan)方法。

　　05如何詳細(xi)計算(suan)檢出(chu)限(xian)

　　在如何正(zheng)確(que)(que)或準確(que)(que)地(di)估(gu)算(suan)檢(jian)出限(xian)的(de)問題上,國際分(fen)析界一直存有爭議(yi)。檢(jian)出限(xian)的(de)特殊(shu)意(yi)義(yi)在于(yu)可(ke)以對一個(ge)給定的(de)分(fen)析方法在低濃(nong)度(du)水(shui)平的(de)檢(jian)測(ce)能(neng)力進(jin)行準確(que)(que)地(di)評估(gu)，而(er)考(kao)察一個(ge)分(fen)析方法在低濃(nong)度(du)范圍的(de)檢(jian)測(ce)性(xing)能(neng)，可(ke)以基于(yu)不(bu)同的(de)角度(du)或不(bu)同的(de)側重點,如可(ke)以從最小信號(hao)值與(yu)儀器噪音(yin)之(zhi)比來(lai)考(kao)察，從方法測(ce)定空白(bai)的(de)平均波動性(xing)來(lai)統計(ji)估(gu)算(suan),也可(ke)以根(gen)據分(fen)析方法校準曲(qu)線(xian)的(de)偏差特性(xing)來(lai)定量估(gu)算(suan)等等。

　　檢(jian)出(chu)(chu)限是評價一個分析方(fang)法及測試儀器(qi)性能的重要指(zhi)標,所謂“檢(jian)出(chu)(chu)”是指(zhi)定性檢(jian)出(chu)(chu)，即判定樣(yang)品中存在有(you)濃度高于(yu)空(kong)白的待測物質(zhi)。

　　ACS(美國化學(xue)學(xue)會)對(dui)這一定義作(zuo)了更簡(jian)明(ming)的(de)概括:檢(jian)出限是一個分析方法能夠可靠地(di)檢(jian)測出被分析物的(de)最(zui)低濃度(du)。

　　1、檢(jian)測限(limit of detection, LOD)定義(yi):

　　在樣(yang)(yang)品中能檢出的(de)(de)被測(ce)組分的(de)(de)最低(di)濃(nong)度(du)(量(liang))稱為檢測(ce)限，即產生信號(峰高)為基線噪音標準差k倍(bei)時的(de)(de)樣(yang)(yang)品濃(nong)度(du)，一(yi)般(ban)為信噪比(bi)(S/N)2:1或3:1時的(de)(de)濃(nong)度(du)，對其測(ce)定的(de)(de)準確度(du)和(he)精密(mi)度(du)沒有確定的(de)(de)要(yao)求。目前，一(yi)般(ban)將檢測(ce)限定義為信噪比(bi)(S/N)3:1時的(de)(de)濃(nong)度(du)。

　　2、計算公式為：

　　D=3N/S (1)

　　式中：N——噪音; S——檢測(ce)器(qi)靈敏度;D——檢測(ce)限

　　將式(1)和式(2)合(he)并，得(de)到下式：D=3N×Q/I (3)

　　式中：Q——進樣(yang)(yang)量;N——噪音;I——信(xin)(xin)號響應值。I/N即為該進樣(yang)(yang)量下(xia)的(de)信(xin)(xin)噪比(bi)(S/N)，該信(xin)(xin)噪比(bi)可通過工(gong)作(zuo)(zuo)站對(dui)圖譜進行(xing)自動分(fen)析獲(huo)得(de)，一般(ban)的(de)色(se)譜或質譜工(gong)作(zuo)(zuo)站都可進行(xing)信(xin)(xin)噪比(bi)分(fen)析計算(suan)。這樣(yang)(yang)檢(jian)測(ce)限的(de)計算(suan)方(fang)法就變得(de)非常方(fang)便了。

　　3、計算方法：

　　實際(ji)計(ji)算時，檢出(chu)限有2種表示方(fang)法：一(yi)種是進(jin)樣(yang)瓶中(zhong)樣(yang)品檢測限，一(yi)種是針對原始樣(yang)品的方(fang)法檢出(chu)限。

　　A、對第一種檢(jian)測限，只要知道進樣量和(he)信噪比即可計算。如進樣瓶(ping)中樣品濃度(du)(du)為(wei)1 mg/L,在此濃度(du)(du)下的信噪比為(wei)300(由工作站(zhan)分(fen)析獲得)，則(ze)其(qi)檢(jian)測限為(wei)：D =(3×1 mg L-1)/300 = 0.01 mg/L。也(ye)可用絕對進樣量表示，若(ruo)進樣體積為(wei)10 uL，則(ze)其(qi)檢(jian)測限為(wei)：D = 3×(1 mgL-1×10 ul)/300 = 0.1 ng。

　　B、對第二種(zhong)表示方(fang)(fang)法(fa)，需同時考(kao)慮(lv)原始樣品的(de)取(qu)樣量(liang)和提取(qu)樣品的(de)定容體(ti)積。仍按前述(shu)樣品計算，若取(qu)樣量(liang)為(wei)5克，最后(hou)定容體(ti)積為(wei)5 mL，則方(fang)(fang)法(fa)檢測限為(wei)：D = 0.01 mgL-1×5 mL/5 g = 0.01 mg/kg。

　　即當(dang)原始樣(yang)品中(zhong)待檢物(wu)質的濃(nong)度(du)為(wei)(wei)0.01mg/kg時，若取樣(yang)量為(wei)(wei)5g,樣(yang)品經前處理后定(ding)容體積(ji)為(wei)(wei)5mL時,進樣(yang)瓶中(zhong)樣(yang)品的濃(nong)度(du)可達0.01mg/L(假定(ding)回(hui)收(shou)率(lv)為(wei)(wei)100%),此時，在(zai)其它給定(ding)的分析條件下(xia)，能產(chan)生3倍噪聲強度(du)的信號。在(zai)實際檢測工作中(zhong)，第二種(zhong)表示方法更為(wei)(wei)常(chang)見(jian)。

　　4、注意事項

　　由式(3)可見(jian)，信噪(zao)比(bi)的(de)(de)大小直(zhi)接關系到(dao)檢(jian)測限的(de)(de)大小。信噪(zao)比(bi)計(ji)算(suan)方(fang)法的(de)(de)不(bu)同(tong)(tong)，其比(bi)值大小有(you)很大不(bu)同(tong)(tong)，這與計(ji)算(suan)信噪(zao)比(bi)時基(ji)線噪(zao)聲峰值的(de)(de)定義(yi)方(fang)式有(you)關，一般有(you)三種不(bu)同(tong)(tong)的(de)(de)定義(yi)：

　　A、峰(feng)/峰(feng)(peak to peak)信噪比，用某一(yi)段(duan)基線噪聲的平均高度;

　　B、峰/半(ban)峰(half peak to peak)信噪(zao)比, 用某一段基線噪(zao)聲平(ping)均高度的(de)1/2;

　　C、均方根(RMS)信噪比，用(yong)某一段基線噪聲的(de)均方根值計算。

　　除(chu)此之外，信噪比的(de)(de)計(ji)算(suan)結果還和所取(qu)(qu)噪聲的(de)(de)位置有很大關系，取(qu)(qu)信號哪一(yi)側(ce)基(ji)線的(de)(de)噪聲，取(qu)(qu)多(duo)長一(yi)段基(ji)線上的(de)(de)噪聲，計(ji)算(suan)結果都(dou)很不完全(quan)相同，有時相差甚(shen)遠。一(yi)般多(duo)取(qu)(qu)樣品峰兩側(ce)的(de)(de)噪聲峰值計(ji)算(suan)。

　　5、檢(jian)出限的(de)確定

　　A、《全球環境監測系統水監測操作指(zhi)南》中(zhong)規(gui)定(ding)：給定(ding)置(zhi)信(xin)水平(ping)為(wei)95%時(shi)，樣(yang)品測定(ding)值與(yu)零濃度(du)樣(yang)品的測定(ding)值有顯著性差異即為(wei)檢出限：

　　L = 4.6Sb式中：

　　L——方法的最(zui)低檢出濃度。

　　Sb ——測(ce)(ce)定次數(shu)為(wei)n次的空白(bai)平行測(ce)(ce)定(批(pi)內(nei))標準差(重(zhong)復測(ce)(ce)定20次以上)。

　　B、國際純(chun)粹(cui)和應(ying)用化學(xue)聯合會(IUPAC)規(gui)定對各種光學(xue)分析(xi)方法，可用下式計(ji)算：

　　L = KSb/S

　　L——方法的最低檢出濃度

　　Sb——空白多次測量的標準偏差(cha)(吸光度);

　　S ——方(fang)法(fa)的靈敏度(即校準曲線(xian)的斜率(lv))

　　為了評估(gu) ，空白測定次數必(bi)須足夠多，最好能測20次。國際純(chun)粹和(he)應(ying)用(yong)化(hua)學聯(lian)合(he)會(hui)極力提倡(chang)取(qu)k值為3，一般來說，取(qu) 相應(ying)的置信水平大約為90%。

　　若 =0，并(bing)不意味著 ，或檢出限無限小。這時需配制一個(ge)濃度略大于零濃度的(de)試樣系列(能產生一個(ge)可測信(xin)號值)代替全程序空白(bai)試驗，求(qiu)出其標(biao)準偏差，用來代替 。

　　此(ci)外，有時為(wei)了工(gong)作方(fang)便和便于(yu)比(bi)較，也規定(ding)一個大家能(neng)接受(shou)的信號(hao)值作為(wei)檢(jian)出(chu)限(xian)，如(ru)分光光度法中，規定(ding)吸光度為(wei)0.010所對應的濃度即為(wei)檢(jian)出(chu)限(xian)L。

　　C、 美國EPA SW—846規定方法中的檢出(chu)限為：

　　L=3.143Sb

　　D、某些分(fen)光(guang)(guang)光(guang)(guang)度法(fa)是以吸光(guang)(guang)度(扣除空白)為0.010相對(dui)應的濃度值或絕對(dui)量為檢出限，這是一(yi)種(zhong)實驗室間的協(xie)定方案。

　　E、氣相色(se)譜法：檢測(ce)器恰能產(chan)生(sheng)與噪音相區(qu)別的響應信號時所需進入(ru)色(se)譜的物(wu)質最小量(liang)為(wei)檢出(chu)限，一(yi)般為(wei)噪音的二倍。

　　F、離子選擇電極法(fa)：當(dang)校準曲線的(de)直線部(bu)分外延的(de)延長線與(yu)通過空白(bai)電位且(qie)平(ping)行于濃(nong)度軸(zhou)的(de)直線相交(jiao)時，其交(jiao)點所對應的(de)濃(nong)度值(zhi)即(ji)為該離子色譜(pu)所對電極法(fa)的(de)檢出(chu)限。

　　由測得(de)的(de)空白(bai)值計算出的(de)L值不應大(da)于(yu)分析方法規(gui)定(ding)的(de)最低檢(jian)出濃度值，如大(da)于(yu)方法規(gui)定(ding)值時，必須尋找原(yuan)因降低空白(bai)值，重新測定(ding)計算至合格。

　　6、校正曲(qu)線繪制：

　　A、按分(fen)析方(fang)法步(bu)驟(zou)，通過實測(ce)(ce)濃度和儀器信號值的直(zhi)線(xian)關(guan)系，確(que)定實驗室條件下的測(ce)(ce)定上(shang)限(xian)。當(dang)測(ce)(ce)定上(shang)限(xian)低于方(fang)法的檢測(ce)(ce)上(shang)限(xian)時，只能(neng)用實測(ce)(ce)的直(zhi)線(xian)范圍。

　　B、繪制校(xiao)正曲(qu)線的分(fen)析步驟(zou)應與樣(yang)品分(fen)析相同，并且不少于5個濃度值(zhi)。

　　C、校(xiao)正曲線繪制(zhi)與每批測定樣(yang)品同時進行，對某些分析方法的(de)校(xiao)正曲線的(de)斜率穩定，批間誤差(cha)較小，使用原(yuan)制(zhi)校(xiao)正曲線時，應與樣(yang)品同時測定2份中等(deng)濃度標樣(yang)和2份空白(bai)的(de)平行樣(yang)。

　　測得標準的濃(nong)度(減(jian)去(qu)空(kong)白)值與(yu)原(yuan)校正(zheng)曲線相(xiang)對(dui)應(ying)的濃(nong)度值的相(xiang)對(dui)偏差(cha)，分光光度應(ying)小于(yu)5%;原(yuan)子吸收法(fa)應(ying)小于(yu)10%，否則重(zhong)新制作(zuo)校正(zheng)曲線。

　　06小(xiao)結

　　最后還要特別強(qiang)調(diao)，檢出(chu)(chu)限和測(ce)定(ding)下限是(shi)兩個(ge)(ge)不(bu)同的概念(nian)(nian)，它們是(shi)評(ping)價一個(ge)(ge)分(fen)析方法及測(ce)試儀(yi)器性(xing)(xing)(xing)能的重(zhong)要指標，檢出(chu)(chu)限是(shi)一個(ge)(ge)定(ding)性(xing)(xing)(xing)概念(nian)(nian)，而測(ce)定(ding)下限是(shi)一個(ge)(ge)定(ding)量概念(nian)(nian)，搞清楚兩者(zhe)概念(nian)(nian)和相(xiang)互關系，可提高色譜分(fen)析中(zhong)檢測(ce)結果的準(zhun)確(que)性(xing)(xing)(xing)和可靠性(xing)(xing)(xing)，特別在痕量分(fen)析中(zhong)，檢出(chu)(chu)限和測(ce)定(ding)下限的確(que)定(ding)對于(yu)分(fen)析方法的選擇具有重(zhong)要意(yi)(yi)義，同樣的，對于(yu)實驗室質量控制(zhi)也具有很重(zhong)要的意(yi)(yi)義。