檢驗方法驗證的基本內容包括方案的起草及審批，檢測儀器的確認。

適用性驗證（包(bao)括準(zhun)確(que)度試(shi)驗、精(jing)密度測定、線(xian)性范圍試(shi)驗、專屬性試(shi)驗等(deng)）和(he)結果評(ping)價及批準(zhun)四個的(de)方面。

首先是制定驗證方案，然后(hou)對大(da)型精密儀器進行確認，最關鍵的(de)一(yi)步(bu)是檢驗方法的(de)適用性試驗，最后(hou)是檢驗方法評價及(ji)批準(zhun)。

1、驗證(zheng)方(fang)案(an)的(de)制定

檢驗方法的(de)驗證(zheng)方案通常(chang)由(you)質(zhi)量驗證(zheng)小組提(ti)出(chu)。根(gen)據產品(pin)的(de)工藝(yi)條件、原輔料化學結構、中間體(ti)、分解產物查閱(yue)有關資料，提(ti)出(chu)規格標(biao)準，確定檢查項目，規定雜(za)質(zhi)限度，即(ji)為質(zhi)量標(biao)準草案。

根據質量標準草案確定檢查和試驗范圍，對檢驗方法擬定具體操作步驟，最后經有關人(ren)員審(shen)批(pi)方可實施。

2、大型精(jing)密儀器的(de)確認

分析測(ce)試(shi)中所用的檢測(ce)儀器一般可分為三類：

A、普通儀器：崩解儀，折光(guang)儀、分(fen)析天平(ping)、酸度計、溶點測定(ding)儀、電(dian)導儀等(deng);

B、較精密儀器：旋光儀、永停滴定儀、費休氏水分(fen)測定儀、 自(zi)動滴定儀、藥物溶(rong)出度儀、可見(jian)分(fen)光光度計、電泳儀等(deng)；

C、大型精密儀器：紫(zi)外(wai)分光光度(du)計(ji)、紅外(wai)分光光度(du)計(ji)、氣相色譜儀、高效液(ye)相色譜儀、薄層掃描儀等。

為了(le)保證分析測試(shi)數據(ju)準確(que)(que)可靠，每臺檢(jian)測儀器在投(tou)入正(zheng)式使用(yong)之(zhi)前都應進(jin)行確(que)(que)認(ren)。

檢測儀器的確認是檢驗(yan)方(fang)法驗(yan)證的基礎(chu)，應在其它驗(yan)證試驗(yan)開(kai)始之(zhi)前首(shou)先完成。

檢測儀(yi)器確認(ren)工作內容應根(gen)據儀(yi)器類型。技術性(xing)能(neng)而定，通常包括：安(an)裝確認(ren)、校正、適用性(xing)預試驗(yan)和(he)再確認(ren)。

3、校正

校(xiao)正(zheng)是(shi)儀器確(que)認(ren)及檢驗方(fang)法驗證中的(de)一個重要環節(jie)，應當(dang)在驗證試驗以前進行(xing)校(xiao)正(zheng)。紫外分(fen)光光度計校(xiao)正(zheng)包括波長校(xiao)正(zheng)、吸收度測試、準確(que)度測試、雜散光檢查。

氣(qi)相(xiang)色(se)譜(pu)儀(yi)與(yu)高效液相(xiang)色(se)譜(pu)儀(yi)均要求做系統適用性試驗。在規定(ding)的色(se)譜(pu)條(tiao)件下測定(ding)色(se)譜(pu)柱的最(zui)小理論塔板(ban)數。分離度和拖尾因(yin)子，并規定(ding)變異系數應不大于2％。

對于化學檢驗中(zhong)使用的計量儀器包括(kuo)容(rong)量瓶、移(yi)液管、滴定管、分析(xi)天平亦均應校正。

4、適用性預(yu)試驗

儀器的(de)安裝確認完成以(yi)后，在其(qi)功(gong)能(neng)試驗(yan)符(fu)合(he)要(yao)求(qiu)的(de)情況(kuang)下，應用標準品或對(dui)照品對(dui)其(qi)進行適用性檢查，以(yi)確認儀器是(shi)否(fou)符(fu)合(he)使用要(yao)求(qiu)。

例如對熔(rong)點測(ce)定儀(yi)的適(shi)用性預試驗是(shi)采用已(yi)知溶點的甲硝唑做試驗，測(ce)試結果與已(yi)知熔(rong)點比較。

紫外(wai)分光光度計可(ke)用已知含量的某標準品試驗，測得結(jie)果與已知數(shu)值對比，確定儀器是否(fou)符(fu)合使用要求。

在完(wan)(wan)成上(shang)述各項試驗工作的同(tong)時，應(ying)做好相應(ying)的文件記錄等資料歸檔(dang)(dang)工作，每一臺儀器(qi)均應(ying)有一套完(wan)(wan)整(zheng)的檔(dang)(dang)案資料。

5、再確認

為了確保(bao)儀(yi)器(qi)(qi)處于良好的使用狀態，對于一臺新購買的儀(yi)器(qi)(qi)在確認工作結(jie)束(shu)以(yi)后，應根據儀(yi)器(qi)(qi)的類別。確認的經驗制(zhi)定再確認的計(ji)劃。

再確認的(de)時間間隔和內容要根據儀器類別和使用情況(kuang)決定，一般是3個(ge)月、6個(ge)月或1年。

儀器再確認的(de)內(nei)容通(tong)常包括線路連(lian)接、附(fu)件(jian)備品(pin)消耗檢查(cha)、清潔(jie)工作(zuo)、功(gong)能(neng)試(shi)(shi)驗、工作(zuo)日記等，其中重點安裝確認中的(de)功(gong)能(neng)試(shi)(shi)驗。

藥(yao)品質(zhi)量標準分(fen)析方(fang)法(fa)驗證的目的是證明采用(yong)的方(fang)法(fa)適合于相應的檢測要求(qiu)。

在起草藥品質(zhi)量標(biao)準時，分析(xi)方法(fa)需經驗證：在藥物生產方法(fa)變更、制(zhi)劑的組(zu)分變更、原分析(xi)方法(fa)進行修(xiu)訂時，則質(zhi)量標(biao)準分析(xi)方法(fa)也需進行驗證。

方法驗證過程和結果均(jun)應(ying)記載在藥品(pin)標(biao)準起草或修訂說(shuo)明中。

根據《中國(guo)藥典》 附(fu)錄XIXA的(de)原則要求，檢驗(yan)方法的(de)驗(yan)證可分為三種情況處理；

1、無(wu)需驗(yan)證(zheng)的方法。如藥(yao)典(dian)(包括(kuo)USP、EP、CP、JP等各國藥(yao)典(dian))的方法，一(yi)般只(zhi)做系統(tong)適用(yong)性試驗(yan)，以(yi)確認系統(tong)是否(fou)(fou)符合要(yao)求(主要(yao)指儀(yi)器穩定性及(ji)柱的分離(li)度是否(fou)(fou)達標)。

2、對比法(fa)。已在(zai)參比實(shi)驗(yan)(yan)(yan)室(shi)驗(yan)(yan)(yan)證(zheng)過的分析方(fang)法(fa)，可(ke)用對比試驗(yan)(yan)(yan)的方(fang)法(fa)來確認方(fang)法(fa)的可(ke)靠性，即將(jiang)本(ben)實(shi)驗(yan)(yan)(yan)室(shi)與參比實(shi)驗(yan)(yan)(yan)室(shi)用同(tong)一方(fang)法(fa)對同(tong)批(pi)樣品所測(ce)數(shu)據進行(xing)比較(如至少取五個批(pi)號，每批(pi)重復測(ce)定五次(ci))，判斷方(fang)法(fa)在(zai)本(ben)實(shi)驗(yan)(yan)(yan)室(shi)的可(ke)行(xing)性。

如有差(cha)異需查明(ming)原(yuan)因或設計方案，對(dui)方法(fa)進行再驗證。

3、需進行系統驗證的方法。

安裝(zhuang)確認及適用性試(shi)驗結束后(hou)，應將(jiang)試(shi)驗數據資料進行匯總分析。對檢驗方法(fa)作(zuo)出正確的評價，驗證報告的說明及結論部分應簡明扼(e)要。

試(shi)驗中的主要偏差應有適當解(jie)釋。然后，報主管領導審批。檢(jian)驗方法(fa)驗證(zheng)的最終產物(wu)是一(yi)個經過驗證(zheng)的方法(fa)—根據驗證(zheng)的結果(guo)制訂的由有關領導批準(zhun)的檢(jian)驗方法(fa)。

在(zai)如何正確(que)(que)或(huo)準(zhun)確(que)(que)地(di)估(gu)算檢(jian)出限(xian)的(de)問(wen)題(ti)上,國際分(fen)析(xi)界一直存有爭議。檢(jian)出限(xian)的(de)特殊意義在(zai)于可(ke)以(yi)對一個(ge)給(gei)定的(de)分(fen)析(xi)方(fang)法(fa)在(zai)低(di)濃度水平(ping)的(de)檢(jian)測(ce)能力進行準(zhun)確(que)(que)地(di)評估(gu)，而考(kao)察一個(ge)分(fen)析(xi)方(fang)法(fa)在(zai)低(di)濃度范圍的(de)檢(jian)測(ce)性能，可(ke)以(yi)基于不(bu)同(tong)的(de)角(jiao)度或(huo)不(bu)同(tong)的(de)側重點,如可(ke)以(yi)從最小信號值與儀器(qi)噪音之比來(lai)考(kao)察，從方(fang)法(fa)測(ce)定空(kong)白的(de)平(ping)均波動性來(lai)統計(ji)估(gu)算,也可(ke)以(yi)根據分(fen)析(xi)方(fang)法(fa)校準(zhun)曲(qu)線(xian)的(de)偏差特性來(lai)定量估(gu)算等(deng)等(deng)。

檢出限(xian)是(shi)評價一(yi)個分析方(fang)法及測試儀器性能的(de)重要指標,所(suo)謂“檢出”是(shi)指定性檢出，即判定樣品中(zhong)存在有濃度(du)高(gao)于(yu)空白的(de)待(dai)測物質。

ACS(美國(guo)化學學會)對這一定義作了更簡明的概括:檢出限(xian)是一個分(fen)(fen)析(xi)方(fang)法(fa)能夠可靠地(di)檢測出被分(fen)(fen)析(xi)物的最低濃度。

1、檢測限（limit of detection, LOD）定義:

在樣品中能檢出的被測組分的最低濃度（量）稱為檢測限，即產生信號（峰高）為基線噪音標準差k倍時的樣品濃度，一般為信噪比（S/N）2:1或3:1時的濃度，對其測定的準確度和精密度沒有確定的要求。目前，一般將檢測限定義為信噪比（S/N）3:1時的濃度。

2、計算(suan)公式為(wei)：

D=3N/S （1）

式(shi)中：N——噪(zao)音; S——檢測器靈敏度；D——檢測限

而靈(ling)敏度的計算公式為：

S=I/Q （2）

式中：S——靈敏度(du)；I——信(xin)號響應值(zhi)；Q——進樣量

將式(shi)（1）和式(shi)（2）合并(bing)，得到(dao)下式(shi)：

D=3N×Q/I (3)

式(shi)中(zhong)：Q——進樣(yang)量；N——噪(zao)音；I——信(xin)(xin)號響應值(zhi)。I/N即為(wei)該(gai)進樣(yang)量下的(de)信(xin)(xin)噪(zao)比（S/N），該(gai)信(xin)(xin)噪(zao)比可通過工作站(zhan)對圖譜(pu)進行自動分析獲得，一般的(de)色(se)譜(pu)或(huo)質譜(pu)工作站(zhan)都可進行信(xin)(xin)噪(zao)比分析計(ji)算(suan)。這樣(yang)檢測限的(de)計(ji)算(suan)方(fang)法就變(bian)得非常方(fang)便了。

3、計算方法：

實際計算時，檢出限有2種表示方法：一種是進樣瓶中樣品檢測限，一種是針對原始樣品的方法檢出限。

A、對第一種檢測(ce)限(xian)(xian)，只要知道進(jin)樣量(liang)和信(xin)噪比即可(ke)計算(suan)。如進(jin)樣瓶(ping)中(zhong)樣品濃(nong)度(du)為(wei)1 mg/L,在此濃(nong)度(du)下的信(xin)噪比為(wei)300(由工(gong)作站分析獲得)，則(ze)其(qi)(qi)檢測(ce)限(xian)(xian)為(wei)：D =（3×1 mg L-1）/300 = 0.01 mg/L。也(ye)可(ke)用(yong)絕對進(jin)樣量(liang)表示，若(ruo)進(jin)樣體(ti)積為(wei)10 ul，則(ze)其(qi)(qi)檢測(ce)限(xian)(xian)為(wei)：D = 3×（1 mgL-1×10 ul）/300 = 0.1 ng。

B、對第二種表(biao)示方(fang)(fang)法，需(xu)同(tong)時考慮原始樣(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)的取(qu)(qu)樣(yang)(yang)(yang)量(liang)和提(ti)取(qu)(qu)樣(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)的定(ding)容體(ti)積(ji)。仍按(an)前述樣(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)計算，若(ruo)取(qu)(qu)樣(yang)(yang)(yang)量(liang)為5克，最后定(ding)容體(ti)積(ji)為5 mL，則方(fang)(fang)法檢測限為：D = 0.01 mgL-1×5 mL/5 g = 0.01 mg/kg。

即當原始樣(yang)(yang)品(pin)中(zhong)待檢(jian)物質的(de)濃(nong)(nong)度(du)(du)為(wei)(wei)0.01mg/kg時，若(ruo)取(qu)樣(yang)(yang)量為(wei)(wei)5g,樣(yang)(yang)品(pin)經前處理后定容體積(ji)為(wei)(wei)5mL時,進樣(yang)(yang)瓶中(zhong)樣(yang)(yang)品(pin)的(de)濃(nong)(nong)度(du)(du)可達0.01mg/L（假定回收(shou)率(lv)為(wei)(wei)100%）,此時，在其它(ta)給定的(de)分析條件下，能產(chan)生3倍噪(zao)聲強度(du)(du)的(de)信號(hao)。在實(shi)際檢(jian)測工作中(zhong)，第二種(zhong)表(biao)示方法更為(wei)(wei)常(chang)見。

4、注意事項

由式（3）可見，信噪比的大小直接關系到檢測限的大小。信噪比計算方法的不同，其比值大小有很大不同，這與計算信噪比時基線噪聲峰值的定義方式有關，一般有三種不同的定義：

A、峰/峰（peak to peak）信噪比，用某一段基線噪聲的(de)平均(jun)高度；

B、峰/半(ban)峰（half peak to peak）信噪(zao)比, 用(yong)某一段基線噪(zao)聲平均高(gao)度的1/2；

C、均(jun)方根(gen)（RMS）信噪(zao)比，用某一(yi)段(duan)基線噪(zao)聲(sheng)的均(jun)方根(gen)值計算(suan)。

除此之外，信噪(zao)比(bi)的(de)計(ji)算(suan)(suan)結果(guo)還和所取(qu)(qu)噪(zao)聲(sheng)的(de)位置有很大(da)關系，取(qu)(qu)信號哪一側(ce)基線的(de)噪(zao)聲(sheng)，取(qu)(qu)多(duo)(duo)長一段基線上(shang)的(de)噪(zao)聲(sheng)，計(ji)算(suan)(suan)結果(guo)都很不(bu)完全相同(tong)，有時相差甚遠。一般多(duo)(duo)取(qu)(qu)樣品峰(feng)兩(liang)側(ce)的(de)噪(zao)聲(sheng)峰(feng)值(zhi)計(ji)算(suan)(suan)。

5、檢出限的確定

A、《全球環境監測(ce)(ce)系統水監測(ce)(ce)操作指(zhi)南》中規定(ding)：給定(ding)置信水平(ping)為95%時，樣品(pin)(pin)測(ce)(ce)定(ding)值與零(ling)濃度樣品(pin)(pin)的測(ce)(ce)定(ding)值有顯著(zhu)性差(cha)異即為檢出(chu)限：

L = 4.6Sb

式中(zhong)：L——方法的最低檢出(chu)濃度。

Sb ——測(ce)(ce)定(ding)(ding)次(ci)數為n次(ci)的空白平行測(ce)(ce)定(ding)(ding)（批內(nei)）標準(zhun)差（重復測(ce)(ce)定(ding)(ding)20次(ci)以上）。

B、國際(ji)純粹和應用(yong)化(hua)學聯合會（IUPAC）規定(ding)對各種光學分(fen)析方法，可用(yong)下(xia)式計算：

L = KSb/S

L——方法(fa)的最(zui)低檢出濃度

Sb——空(kong)白多次測(ce)量的標(biao)準偏差（吸光度）；

S ——方(fang)法的靈敏度（即(ji)校準曲線的斜率）

為(wei)(wei)了評(ping)估 ，空白測(ce)定次(ci)數必(bi)須足夠多(duo)，最好能測(ce)20次(ci)。國際純粹(cui)和應用化學聯合(he)會極力提倡取k值為(wei)(wei)3，一(yi)般來說(shuo)，取 相應的置信(xin)水平(ping)大約為(wei)(wei)90%。

若 =0，并(bing)不意(yi)味著(zhu) ，或檢出限無限小。這時需配制一(yi)個(ge)(ge)濃(nong)(nong)度略大于(yu)零濃(nong)(nong)度的試樣系列（能(neng)產生一(yi)個(ge)(ge)可(ke)測信號值）代(dai)替(ti)全程序空白試驗，求出其(qi)標準偏差，用來代(dai)替(ti) 。

此外，有時(shi)為(wei)(wei)了工作(zuo)方便和(he)便于(yu)比較，也(ye)規(gui)定(ding)一個大家能接受(shou)的(de)信號值作(zuo)為(wei)(wei)檢出限，如分(fen)光光度法中，規(gui)定(ding)吸光度為(wei)(wei)0.010所對應的(de)濃度即為(wei)(wei)檢出限L。

C、 美國EPA SW—846規定方法中的檢出限為：

L=3.143Sb

D、某些分光(guang)光(guang)度(du)法是以吸光(guang)度(du)（扣除空白(bai)）為0.010相對應(ying)的濃度(du)值或絕對量為檢(jian)出限，這(zhe)是一種實(shi)驗室(shi)間的協定(ding)方(fang)案。

E、氣相色(se)譜法：檢測器恰能產生與噪(zao)(zao)音相區別的響應信號時所需進入色(se)譜的物質最小量(liang)為(wei)檢出限，一(yi)般為(wei)噪(zao)(zao)音的二倍。

F、離(li)子選(xuan)擇電(dian)極法(fa)：當(dang)校準曲線(xian)的(de)直線(xian)部分外延(yan)的(de)延(yan)長線(xian)與通(tong)過空白(bai)電(dian)位且(qie)平(ping)行于濃(nong)度軸的(de)直線(xian)相(xiang)交(jiao)(jiao)時(shi)，其交(jiao)(jiao)點所對應的(de)濃(nong)度值(zhi)即為該離(li)子色譜所對電(dian)極法(fa)的(de)檢(jian)出限。

由(you)測(ce)得的空白值計算出的L值不應大于(yu)分析方法(fa)規(gui)定(ding)的最低檢出濃度(du)值，如(ru)大于(yu)方法(fa)規(gui)定(ding)值時，必須尋找原因(yin)降低空白值，重新測(ce)定(ding)計算至合格。

6、校正曲線繪制：

A、按分析方法步驟，通過實測濃度和儀器信號值的直線關系，確定實驗室條件下的測定上限。當測定上限低于方法的檢測上限時，只能用實測的直線范圍。

B、繪制校正曲線的分析步驟應與(yu)樣品分析相同，并且不少(shao)于5個濃度值。

C、校(xiao)正(zheng)(zheng)曲線繪制與(yu)每(mei)批測定樣品(pin)同時(shi)進行，對(dui)某些分析方法的校(xiao)正(zheng)(zheng)曲線的斜率穩定，批間(jian)誤差較小，使(shi)用原制校(xiao)正(zheng)(zheng)曲線時(shi)，應與(yu)樣品(pin)同時(shi)測定2份中等濃度標樣和2份空白的平行樣。

測得標準的濃度(du)(du)（減去空白(bai)）值(zhi)與原校正曲線相對應的濃度(du)(du)值(zhi)的相對偏差，分光光度(du)(du)應小(xiao)于5%；原子吸收(shou)法(fa)應小(xiao)于10%，否(fou)則重新制作校正曲線。

最后還要特別強調，檢出限和測定下限是兩個不同的概念，它們是評價一個分析方法及測試儀器性能的重要指標，檢出限是一個定性概念，而測定下限是一個定量概念，搞清楚兩者概念和相互關系，可提高色譜分析中檢測結果的準確性和可靠性，特別在痕量分析中，檢出限和測定下限的確定對于分析方法的選擇具有重要意義，同樣的，對于實驗室質量控制也具有很重要的意義。