檢驗(yan)方法(fa)驗(yan)證(zheng)的(de)基本內容包括方案(an)的(de)起(qi)草(cao)及審批，檢測儀器(qi)的(de)確認。

適用性(xing)(xing)(xing)驗(yan)證（包括準確(que)度(du)試(shi)(shi)驗(yan)、精(jing)密度(du)測定(ding)、線(xian)性(xing)(xing)(xing)范圍試(shi)(shi)驗(yan)、專屬(shu)性(xing)(xing)(xing)試(shi)(shi)驗(yan)等(deng)）和(he)結果評(ping)價及批準四個的方(fang)面(mian)。

首(shou)先是制定驗(yan)證(zheng)方案，然后(hou)對大(da)型精(jing)密儀器進行確認，最關鍵的(de)一步是檢(jian)(jian)驗(yan)方法的(de)適用(yong)性試驗(yan)，最后(hou)是檢(jian)(jian)驗(yan)方法評(ping)價及批準。

1、驗證方案的(de)制定

檢驗(yan)方法的(de)驗(yan)證方案通(tong)常(chang)由(you)質量(liang)驗(yan)證小組(zu)提(ti)出(chu)。根據產(chan)品的(de)工藝條件、原(yuan)輔(fu)料化學結構、中(zhong)間(jian)體、分解產(chan)物查閱有關資(zi)料，提(ti)出(chu)規格標(biao)準，確定檢查項目，規定雜(za)質限度，即為質量(liang)標(biao)準草案。

根(gen)據(ju)質量標(biao)準(zhun)草案確定(ding)檢查和試驗(yan)范圍(wei)，對檢驗(yan)方法擬(ni)定(ding)具體(ti)操作(zuo)步驟(zou)，最后經有(you)關人(ren)員審批方可(ke)實(shi)施。

2、大型精(jing)密儀器的確認

分(fen)析測試中(zhong)所用(yong)的檢測儀器(qi)一般可分(fen)為(wei)三類：

A、普通(tong)儀器：崩解儀，折光儀、分(fen)析(xi)天平、酸度計、溶點測定儀、電導儀等;

B、較精密儀器(qi)：旋光(guang)(guang)儀、永停滴定(ding)(ding)儀、費休氏水分測定(ding)(ding)儀、 自動滴定(ding)(ding)儀、藥(yao)物(wu)溶出度(du)儀、可見分光(guang)(guang)光(guang)(guang)度(du)計、電泳儀等；

C、大型(xing)精密儀(yi)器(qi)：紫(zi)外(wai)分光光度計、紅(hong)外(wai)分光光度計、氣相色譜(pu)儀(yi)、高效液相色譜(pu)儀(yi)、薄層掃描儀(yi)等(deng)。

為了(le)保證分析測試(shi)數(shu)據準確(que)可靠，每臺檢測儀(yi)器在投入正式使用之前(qian)都應進行確(que)認。

檢測儀器的確認是檢驗方法驗證(zheng)的基礎，應在其它驗證(zheng)試(shi)驗開始之前(qian)首先完(wan)成。

檢測儀器(qi)確(que)(que)認(ren)工作(zuo)內容應根據(ju)儀器(qi)類(lei)型。技術性能而定(ding)，通常包括：安裝確(que)(que)認(ren)、校正、適用性預試驗和再確(que)(que)認(ren)。

3、校正

校(xiao)正(zheng)是儀器確(que)認及檢驗方法驗證(zheng)中的一個(ge)重要(yao)環節(jie)，應當在驗證(zheng)試(shi)(shi)驗以前進行校(xiao)正(zheng)。紫外分光光度計校(xiao)正(zheng)包括波長校(xiao)正(zheng)、吸收度測(ce)試(shi)(shi)、準確(que)度測(ce)試(shi)(shi)、雜(za)散光檢查。

氣相色譜(pu)儀(yi)與(yu)高效液相色譜(pu)儀(yi)均要求做系(xi)統適用性試驗。在(zai)規(gui)定的色譜(pu)條件下測定色譜(pu)柱的最(zui)小理論塔板(ban)數。分離度(du)和拖尾因子(zi)，并規(gui)定變異系(xi)數應不大于(yu)2％。

對于(yu)化學檢(jian)驗中(zhong)使(shi)用(yong)的計量(liang)儀器(qi)包括容量(liang)瓶、移液管、滴定管、分析天平亦均(jun)應校正。

4、適用(yong)性預試驗

儀器的(de)安裝(zhuang)確(que)認完成以后，在(zai)其功能(neng)試驗符合(he)要求的(de)情(qing)況下，應用(yong)標準品(pin)或對(dui)照(zhao)品(pin)對(dui)其進行適用(yong)性(xing)檢查，以確(que)認儀器是否(fou)符合(he)使用(yong)要求。

例(li)如對熔點測定儀的(de)適(shi)用性預試驗(yan)是(shi)采用已(yi)知(zhi)溶點的(de)甲硝唑做試驗(yan)，測試結果與已(yi)知(zhi)熔點比(bi)較。

紫外分(fen)光光度計可用(yong)已知(zhi)含量的(de)某(mou)標(biao)準品試驗，測(ce)得(de)結果與(yu)已知(zhi)數值對(dui)比(bi)，確定(ding)儀(yi)器是(shi)否符合(he)使用(yong)要求。

在完成上(shang)述各(ge)項試驗工(gong)作的同(tong)時，應做好相應的文件記錄(lu)等資(zi)(zi)料歸檔工(gong)作，每一(yi)臺儀器均應有一(yi)套完整(zheng)的檔案(an)資(zi)(zi)料。

5、再確認

為了確(que)保儀(yi)(yi)器處于(yu)良(liang)好的使用狀態，對于(yu)一臺新購買的儀(yi)(yi)器在確(que)認(ren)(ren)工作結束以(yi)后，應根(gen)據儀(yi)(yi)器的類(lei)別。確(que)認(ren)(ren)的經驗(yan)制定再確(que)認(ren)(ren)的計(ji)劃。

再確認的時(shi)間(jian)間(jian)隔和內容要根據(ju)儀器(qi)類別和使(shi)用情況決定(ding)，一般(ban)是3個(ge)月(yue)、6個(ge)月(yue)或1年。

儀器再確認的內容(rong)通常(chang)包括線路(lu)連(lian)接、附件(jian)備品消耗檢查、清潔工作、功(gong)能試驗、工作日記等，其(qi)中重點(dian)安裝確認中的功(gong)能試驗。

藥(yao)品質量標準分析方(fang)法驗證的(de)目的(de)是證明采用的(de)方(fang)法適合于相應的(de)檢測要求。

在起草藥品質(zhi)量(liang)標(biao)準(zhun)時(shi)，分(fen)(fen)析(xi)方(fang)法需(xu)經(jing)驗證(zheng)：在藥物生產方(fang)法變(bian)更、制劑的組(zu)分(fen)(fen)變(bian)更、原分(fen)(fen)析(xi)方(fang)法進(jin)行(xing)修(xiu)訂時(shi)，則質(zhi)量(liang)標(biao)準(zhun)分(fen)(fen)析(xi)方(fang)法也(ye)需(xu)進(jin)行(xing)驗證(zheng)。

方法驗(yan)證(zheng)過程和結果(guo)均(jun)應記載在藥品標準起草或(huo)修訂(ding)說明中。

根據《中國藥典》附錄XIXA的原則要求，檢驗方法的驗證可分為三種情況處理；

1、無需驗(yan)證的方法(fa)。如(ru)藥典（包(bao)括USP、EP、CP、JP等各國藥典)的方法(fa)，一般只做系(xi)統適用性(xing)試驗(yan)，以確認系(xi)統是(shi)否符(fu)合要求(主要指儀器穩定性(xing)及柱的分離度(du)是(shi)否達(da)標(biao)）。

2、對(dui)比法(fa)。已在(zai)參比實驗(yan)室驗(yan)證過的分析方法(fa)，可用對(dui)比試驗(yan)的方法(fa)來確認方法(fa)的可靠性，即將本(ben)實驗(yan)室與參比實驗(yan)室用同一方法(fa)對(dui)同批(pi)樣品所測數據(ju)進行(xing)比較(jiao)(如至(zhi)少取五個批(pi)號，每批(pi)重(zhong)復(fu)測定五次)，判斷方法(fa)在(zai)本(ben)實驗(yan)室的可行(xing)性。

如(ru)有差(cha)異需查(cha)明原因或設計方(fang)案，對方(fang)法進行再驗證。

3、需進行(xing)系統驗證的方(fang)法。

安裝確認及適用性試驗(yan)結束后，應(ying)將試驗(yan)數據資料(liao)進行(xing)匯總分(fen)析。對(dui)檢(jian)驗(yan)方法作出正確的評價，驗(yan)證報告的說明及結論部(bu)分(fen)應(ying)簡明扼要。

試驗(yan)中(zhong)的(de)主要偏差應(ying)有適當解釋。然后(hou)，報主管領(ling)導審批(pi)。檢驗(yan)方(fang)(fang)法驗(yan)證(zheng)的(de)最終(zhong)產物是一個經過驗(yan)證(zheng)的(de)方(fang)(fang)法—根據驗(yan)證(zheng)的(de)結果制訂(ding)的(de)由(you)有關領(ling)導批(pi)準的(de)檢驗(yan)方(fang)(fang)法。

在(zai)(zai)如(ru)何正確(que)或準(zhun)(zhun)確(que)地(di)估算(suan)檢(jian)(jian)出限的(de)(de)問題上(shang),國際分(fen)(fen)析界一直存(cun)有(you)爭議。檢(jian)(jian)出限的(de)(de)特(te)殊意(yi)義在(zai)(zai)于可以對一個給定(ding)(ding)的(de)(de)分(fen)(fen)析方法(fa)在(zai)(zai)低(di)濃度水(shui)平的(de)(de)檢(jian)(jian)測(ce)能(neng)力進(jin)行準(zhun)(zhun)確(que)地(di)評估，而考(kao)察一個分(fen)(fen)析方法(fa)在(zai)(zai)低(di)濃度范圍的(de)(de)檢(jian)(jian)測(ce)性(xing)能(neng)，可以基(ji)于不同的(de)(de)角度或不同的(de)(de)側重點,如(ru)可以從(cong)最小信號值(zhi)與儀器噪音之比來(lai)考(kao)察，從(cong)方法(fa)測(ce)定(ding)(ding)空白的(de)(de)平均波動(dong)性(xing)來(lai)統計估算(suan),也可以根(gen)據(ju)分(fen)(fen)析方法(fa)校(xiao)準(zhun)(zhun)曲線的(de)(de)偏差特(te)性(xing)來(lai)定(ding)(ding)量估算(suan)等等。

檢出(chu)限是(shi)評(ping)價一個分(fen)析(xi)方(fang)法(fa)及測(ce)試儀(yi)器性(xing)能的重(zhong)要指標(biao),所(suo)謂“檢出(chu)”是(shi)指定性(xing)檢出(chu)，即判定樣品中(zhong)存在有濃度高(gao)于空白的待(dai)測(ce)物質。

ACS(美國化學(xue)學(xue)會)對這一定(ding)義作(zuo)了(le)更簡(jian)明的(de)概(gai)括:檢出(chu)限是(shi)一個(ge)分(fen)析(xi)方法能夠(gou)可(ke)靠地檢測出(chu)被分(fen)析(xi)物的(de)最低濃(nong)度。

1、檢測(ce)限（limit of detection, LOD）定義

在樣品中能檢(jian)出(chu)的(de)(de)被測(ce)(ce)組分的(de)(de)最低(di)濃(nong)(nong)(nong)度(du)（量）稱為(wei)(wei)檢(jian)測(ce)(ce)限(xian)，即產生信號（峰(feng)高(gao)）為(wei)(wei)基線(xian)噪(zao)音(yin)標準(zhun)(zhun)差k倍時(shi)(shi)的(de)(de)樣品濃(nong)(nong)(nong)度(du)，一般為(wei)(wei)信噪(zao)比(bi)（S/N）2:1或3:1時(shi)(shi)的(de)(de)濃(nong)(nong)(nong)度(du)，對其測(ce)(ce)定的(de)(de)準(zhun)(zhun)確度(du)和精密度(du)沒有(you)確定的(de)(de)要求(qiu)。目前，一般將檢(jian)測(ce)(ce)限(xian)定義為(wei)(wei)信噪(zao)比(bi)（S/N）3:1時(shi)(shi)的(de)(de)濃(nong)(nong)(nong)度(du)。

2、計算公(gong)式(shi)

D=3N/S （1）

式中：N——噪(zao)音; S——檢(jian)(jian)測(ce)器靈敏(min)度；D——檢(jian)(jian)測(ce)限

而靈敏度的計(ji)算(suan)公(gong)式為：

S=I/Q （2）

式中：S——靈敏度；I——信(xin)號響(xiang)應值；Q——進樣量(liang)

將式（1）和(he)式（2）合并，得(de)到(dao)下式：

D=3N×Q/I (3)

式中(zhong)：Q——進(jin)(jin)樣(yang)量；N——噪音；I——信(xin)號響應值(zhi)。I/N即為該進(jin)(jin)樣(yang)量下(xia)的(de)信(xin)噪比（S/N），該信(xin)噪比可通過工(gong)作站對圖譜進(jin)(jin)行(xing)自動分析獲得，一般的(de)色譜或質譜工(gong)作站都可進(jin)(jin)行(xing)信(xin)噪比分析計算。這樣(yang)檢測限的(de)計算方法就變得非常方便(bian)了。

3、計算方法

實際計(ji)算時，檢出(chu)限(xian)有2種(zhong)(zhong)表示(shi)方法(fa)(fa)：一種(zhong)(zhong)是進樣瓶中樣品(pin)(pin)檢測限(xian)，一種(zhong)(zhong)是針(zhen)對原(yuan)始樣品(pin)(pin)的方法(fa)(fa)檢出(chu)限(xian)。

A、對(dui)第一種檢測(ce)(ce)限(xian)，只(zhi)要(yao)知道進(jin)樣(yang)(yang)(yang)量和信噪(zao)比即(ji)可計算。如進(jin)樣(yang)(yang)(yang)瓶中樣(yang)(yang)(yang)品濃(nong)度為(wei)(wei)1 mg/L,在此濃(nong)度下的信噪(zao)比為(wei)(wei)300(由工作站分析獲得)，則其檢測(ce)(ce)限(xian)為(wei)(wei)：D =（3×1 mg L-1）/300 = 0.01 mg/L。也(ye)可用(yong)絕(jue)對(dui)進(jin)樣(yang)(yang)(yang)量表示，若進(jin)樣(yang)(yang)(yang)體積為(wei)(wei)10 ul，則其檢測(ce)(ce)限(xian)為(wei)(wei)：D = 3×（1 mgL-1×10 ul）/300 = 0.1 ng。

B、對第二種表示方(fang)法(fa)(fa)，需同時考慮原始樣(yang)品(pin)的取樣(yang)量和提取樣(yang)品(pin)的定容體積(ji)。仍(reng)按前述樣(yang)品(pin)計算，若取樣(yang)量為5克，最后定容體積(ji)為5 mL，則方(fang)法(fa)(fa)檢(jian)測限(xian)為：D = 0.01 mgL-1×5 mL/5 g = 0.01 mg/kg。

即當原(yuan)始樣品中(zhong)(zhong)待檢物(wu)質的濃度(du)為(wei)(wei)0.01mg/kg時(shi)，若取(qu)樣量為(wei)(wei)5g,樣品經前處理后定(ding)容(rong)體積為(wei)(wei)5mL時(shi),進樣瓶中(zhong)(zhong)樣品的濃度(du)可達0.01mg/L（假定(ding)回(hui)收(shou)率為(wei)(wei)100%）,此時(shi)，在其(qi)它給定(ding)的分析條(tiao)件下(xia)，能產生3倍噪聲強度(du)的信(xin)號。在實際檢測(ce)工作中(zhong)(zhong)，第二種(zhong)表示方法更為(wei)(wei)常見。

4、注(zhu)意(yi)事項

由式（3）可見，信噪(zao)比(bi)(bi)的(de)(de)大(da)小直(zhi)接關系到(dao)檢測限(xian)的(de)(de)大(da)小。信噪(zao)比(bi)(bi)計算方法的(de)(de)不(bu)同(tong)(tong)(tong)，其比(bi)(bi)值大(da)小有很大(da)不(bu)同(tong)(tong)(tong)，這(zhe)與計算信噪(zao)比(bi)(bi)時基(ji)線噪(zao)聲(sheng)峰值的(de)(de)定義方式有關，一般有三種(zhong)不(bu)同(tong)(tong)(tong)的(de)(de)定義：

A、峰/峰（peak to peak）信噪(zao)比，用某一段基線噪(zao)聲的平均(jun)高度；

B、峰(feng)/半峰(feng)（half peak to peak）信噪比, 用(yong)某一段基線噪聲平均(jun)高(gao)度的(de)1/2；

C、均方根（RMS）信噪比，用某一段基(ji)線噪聲的均方根值計算。

除此之(zhi)外，信噪(zao)比的(de)計算(suan)(suan)結(jie)果(guo)還和所(suo)取(qu)(qu)噪(zao)聲(sheng)的(de)位置有很(hen)(hen)大關系，取(qu)(qu)信號(hao)哪一側(ce)(ce)基(ji)線的(de)噪(zao)聲(sheng)，取(qu)(qu)多長一段(duan)基(ji)線上的(de)噪(zao)聲(sheng)，計算(suan)(suan)結(jie)果(guo)都(dou)很(hen)(hen)不完(wan)全相同，有時相差甚(shen)遠(yuan)。一般多取(qu)(qu)樣品峰兩側(ce)(ce)的(de)噪(zao)聲(sheng)峰值(zhi)計算(suan)(suan)。

5、檢出限的確定

A、《全球環境(jing)監測系統水監測操作指南》中(zhong)規定(ding)：給定(ding)置信水平為95%時，樣品測定(ding)值(zhi)與(yu)零濃(nong)度樣品的測定(ding)值(zhi)有顯(xian)著性差(cha)異即為檢(jian)出(chu)限：

L = 4.6Sb

式中：L——方法的最低(di)檢出濃度。

Sb ——測定(ding)次數(shu)為n次的(de)空(kong)白平行測定(ding)（批內(nei)）標準差（重復測定(ding)20次以上）。

B、國際純(chun)粹和(he)應用化學聯(lian)合(he)會(hui)（IUPAC）規定(ding)對(dui)各(ge)種(zhong)光(guang)學分析方法，可用下式計算(suan)：

L = KSb/S

L——方(fang)法的最(zui)低檢出濃度

Sb——空白(bai)多次(ci)測量(liang)的標(biao)準偏(pian)差（吸光度(du)）；

S ——方(fang)法的靈敏度（即(ji)校準(zhun)曲(qu)線的斜率）

為了(le)評估 ，空白測(ce)定次數(shu)必須足(zu)夠多，最好能測(ce)20次。國際純粹和應(ying)用(yong)化學聯合會極力提倡取k值為3，一般來(lai)說，取 相應(ying)的置信水平大約為90%。

若 =0，并不意味著 ，或檢(jian)出限(xian)無限(xian)小。這時(shi)需配制一個濃(nong)度(du)略大于零濃(nong)度(du)的試樣系列（能產生(sheng)一個可測信(xin)號值）代替(ti)全(quan)程序空白試驗，求出其標準偏差，用(yong)來代替(ti) 。

此(ci)外，有時(shi)為了工作方便(bian)(bian)和便(bian)(bian)于比較，也規定一(yi)個(ge)大家能(neng)接受的(de)信號值作為檢(jian)出(chu)限(xian)，如(ru)分光(guang)光(guang)度法中，規定吸(xi)光(guang)度為0.010所對應的(de)濃度即為檢(jian)出(chu)限(xian)L。

C、 美國EPA SW—846規定方(fang)法中的檢出限為：

L=3.143Sb

D、某些分光(guang)光(guang)度(du)法是以吸光(guang)度(du)（扣除空白）為0.010相對(dui)應(ying)的(de)濃度(du)值(zhi)或絕(jue)對(dui)量(liang)為檢出(chu)限，這是一種實驗室間的(de)協定方案。

E、氣相色(se)譜法：檢(jian)測(ce)器(qi)恰能產生與噪音(yin)相區別(bie)的響應信(xin)號時所(suo)需進入色(se)譜的物質最(zui)小量(liang)為檢(jian)出限，一般為噪音(yin)的二倍。

F、離子選擇(ze)電極(ji)法：當校(xiao)準曲線(xian)的(de)直(zhi)線(xian)部(bu)分外延(yan)的(de)延(yan)長線(xian)與通(tong)過空白電位且平(ping)行于濃度(du)軸的(de)直(zhi)線(xian)相交時(shi)，其(qi)交點所對(dui)應的(de)濃度(du)值(zhi)即(ji)為該離子色譜(pu)所對(dui)電極(ji)法的(de)檢出限。

由(you)測(ce)得的空白值(zhi)計算出(chu)的L值(zhi)不應大(da)于(yu)分析方法規定(ding)的最低(di)檢出(chu)濃度(du)值(zhi)，如大(da)于(yu)方法規定(ding)值(zhi)時，必須(xu)尋找原因降低(di)空白值(zhi)，重新測(ce)定(ding)計算至合格(ge)。

6、校正曲線繪制(zhi)

A、按分析方法(fa)步驟，通過實測(ce)濃度和儀(yi)器信號值的直線關系，確定(ding)實驗室條件下的測(ce)定(ding)上限(xian)(xian)(xian)。當測(ce)定(ding)上限(xian)(xian)(xian)低(di)于(yu)方法(fa)的檢測(ce)上限(xian)(xian)(xian)時，只能用實測(ce)的直線范圍。

B、繪(hui)制校正曲線的分(fen)(fen)析步驟應(ying)與樣(yang)品分(fen)(fen)析相同，并且不(bu)少于5個濃度值。

C、校(xiao)正(zheng)曲(qu)(qu)線(xian)繪制與每批測(ce)(ce)定(ding)樣品(pin)同(tong)時進(jin)行，對某些分析方法的校(xiao)正(zheng)曲(qu)(qu)線(xian)的斜率穩定(ding)，批間誤差較小，使用原制校(xiao)正(zheng)曲(qu)(qu)線(xian)時，應與樣品(pin)同(tong)時測(ce)(ce)定(ding)2份中等濃度標(biao)樣和2份空白的平行樣。

測得標準的濃度(du)（減去空白）值(zhi)與原校正曲(qu)線相(xiang)對應的濃度(du)值(zhi)的相(xiang)對偏差，分光光度(du)應小于5%；原子吸(xi)收法應小于10%，否則重新制(zhi)作校正曲(qu)線。

最后還要特別(bie)強調，檢(jian)出限(xian)(xian)和測定(ding)下限(xian)(xian)是兩個(ge)不同(tong)的(de)概(gai)念(nian)，它們是評價一(yi)(yi)個(ge)分(fen)(fen)析方(fang)法及測(ce)試儀器(qi)性(xing)能的(de)重(zhong)要(yao)指標，檢(jian)(jian)出限(xian)是一(yi)(yi)個(ge)定性(xing)概(gai)念(nian)，而測(ce)定下限(xian)是一(yi)(yi)個(ge)定量概(gai)念(nian)，搞清楚兩者概(gai)念(nian)和相互關系，可(ke)提高色(se)譜分(fen)(fen)析中(zhong)檢(jian)(jian)測(ce)結果的(de)準確(que)性(xing)和可(ke)靠性(xing)，特別在痕量分(fen)(fen)析中(zhong)，檢(jian)(jian)出限(xian)和測(ce)定下限(xian)的(de)確(que)定對(dui)于分(fen)(fen)析方(fang)法的(de)選擇(ze)具有重(zhong)要(yao)意義(yi)，同(tong)樣的(de)，對(dui)于實驗室質量控制(zhi)也具有很(hen)重(zhong)要(yao)的(de)意義(yi)。

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