高效液相色譜技(ji)術最早(zao)應(ying)用于藥物領域，包括效能/純(chun)度(du)/性能分(fen)析(xi)、藥物(代(dai)謝)動(dong)力(li)學/生物分(fen)析(xi)測(ce)試、純(chun)化、高通量篩選(HTS)、過程控制(zhi)(IPC)監測(ce)和質(zhi)量控制(zhi)(QC)測(ce)試。制(zhi)藥行(xing)業是HPLC的主要應(ying)用市場，同(tong)時也是HPLC向更高通量和更優性能發展的主要驅動(dong)力(li)。本文簡要回顧了(le)過去十年(nian)影響藥物分(fen)析(xi)發展的HPLC的重大(da)進展。討論(lun)的主題(ti)如下，部分(fen)項目體現在(zai)一個典型的時間軸上，如圖1所示。
圖1 過去十年中影響藥物分析發展的HPLC技術進展(部分項(xiang)目)
本文的(de)目的(de)是為繁忙的(de)制藥科學家提(ti)供一個(ge)簡潔又全(quan)面的(de)HPLC的(de)重要(yao)的(de)技術進展,每個(ge)主(zhu)題(ti)都有實際使用(yong)過程中的(de)便利和應用(yong)的(de)簡短(duan)描述，從用(yong)戶的(de)角度的(de)評論，以(yi)及主(zhu)要(yao)參考文獻(略(lve))的(de)支撐(cheng)。
超高壓液相色譜(UHPLC)
UHPLC的(de)革命性創新始于(yu)1997年(nian)James Jorgenson教授在(zai)概念驗證方(fang)面的(de)研究，緊接著第一個商業化系統(tong)于(yu)2004年(nian)推出。今天(tian)，從HPLC到UHPLC的(de)轉化大部分(fen)都是由主要制造商完(wan)成(cheng)，這些制造商目前都可以(yi)(yi)供應(ying)(ying)某種類型(xing)的(de)UHPLC產品。UHPLC系統(tong)、柱(zhu)子以(yi)(yi)及應(ying)(ying)用(yong)的(de)詳(xiang)細(xi)綜述(shu)在(zai)其他地方(fang)都可以(yi)(yi)看(kan)到。UHPLC在(zai)藥物(wu)分(fen)析領域的(de)基本原(yuan)理(li)、優(you)勢、潛在(zai)的(de)問題和最佳應(ying)(ying)用(yong)都有充分(fen)的(de)文件(jian)記錄(lu)。
表1概述了UHPLC的(de)(de)(de)突出特點和優勢(shi)。注(zhu)意，較高的(de)(de)(de)系(xi)統(tong)壓力允(yun)許使用(yong)更小(xiao)的(de)(de)(de)微粒(li)填充的(de)(de)(de)柱(zhu)子(如亞(ya)2μm)得到(dao)更快的(de)(de)(de)分析速度(du)(圖2)或(huo)復(fu)雜樣品更出色(se)的(de)(de)(de)分離(圖3)。由于(yu)使用(yong)改良的(de)(de)(de)進樣器(qi)，內徑較小(xiao)的(de)(de)(de)管路系(xi)統(tong)(< 0.005英寸)，更小(xiao)的(de)(de)(de)紫外檢測器(qi)流動(dong)池(0.5 - 2μL)，所(suo)有的(de)(de)(de)UHPLC都有比(bi)較低的(de)(de)(de)系(xi)統(tong)擴散(4σ時，~10-20μL)。比(bi)較典(dian)型的(de)(de)(de)應(ying)用(yong)是內徑為2.1–3.0mm的(de)(de)(de)柱(zhu)子，填充物為亞(ya)2μm或(huo)亞(ya)3μm顆粒(li)。其他重要的(de)(de)(de)系(xi)統(tong)特征包括更小(xiao)的(de)(de)(de)系(xi)統(tong)死體(ti)積(0.1-0.3 mL)和更快的(de)(de)(de)檢測器(qi)響(xiang)應(ying)/數(shu)據采集速率(>40 pt/s)，以(yi)實(shi)現高通量的(de)(de)(de)應(ying)用(yong)。
表1 UHPLC的(de)突出(chu)特點和優勢
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UHPLC的系統特點 |
范圍和評論 |
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最高壓力限制 |
15000到19000psi(1000到1250bar),流(liu)速(su)2-5mL/min.兼容傳統的(de)和亞-2微米顆(ke)粒的(de)色譜柱。 |
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低系(xi)統色散(san) |
根據(ju)儀器配置，儀器帶(dai)寬(kuan)5-20μL（4σ），使(shi)用較小(xiao)的連接管（<0.005"I.D）和小(xiao)UV流通(tong)池（0.5-2μL）,減(jian)小(xiao)系統頻帶(dai)展寬(kuan)。兼容(rong)ID低至(zhi)2-3mm的色譜柱。 |
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低的梯度保留體(ti)積(ji) |
100-400μL（對(dui)于(yu)四元(yuan)液相泵會(hui)更(geng)高(gao)(gao)），兼容高(gao)(gao)通量篩選(xuan)（HTS）。小的保留（混合）體積可(ke)能影(ying)響UV檢測(ce)器(qi)噪聲(sheng)。 |
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其他 |
HTS快速的(de)注射周期(qi)（-20s）和檢(jian)測響應，以及高的(de)采集率（>40pt/t），兼容(rong)目前(qian)的(de)HPLC方(fang)法需求（如流量范圍(wei)、柱溫箱尺寸、進樣環(huan)路(lu)） |
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UHPLC的優勢 |
評論 |
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高通量 |
在(zai)保持相(xiang)似(si)分辨率的情況下，與傳統(tong)的HPLC方法相(xiang)比(bi)通量提高3-10倍。如純度(du)分析5min（UHPLC）/20min（HPLC）。 |
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快速方法(fa)開發 |
短色譜柱，快速(su)分(fen)析是色譜柱和流(liu)動相(xiang)快速(su)篩選(xuan)(xuan)及方(fang)法(fa)優化的理想選(xuan)(xuan)擇。 |
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高分(fen)辨 |
相對于HPLC，分辨率提高3倍，比如(ru)峰容量（Pc）400-600(HPLC為200) |
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溶劑節省(sheng) |
分(fen)析時間短(duan)，使(shi)用較(jiao)小(xiao)ID的色譜柱(zhu)，相比(bi)HPLC溶劑節(jie)省5-15倍(bei)。 |
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高靈(ling)敏度 |
質(zhi)量靈敏度(du)增(zeng)加3-10倍（樣品注(zhu)入量減少）。長路(lu)徑(jing)UV流通(tong)池（50-60min）可以將濃(nong)度(du)靈敏度(du)提高6倍。 |
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高精度 |
保留時(shi)間（2-3倍）和峰面積(ji)(ji)精密度（<1%RSD，進樣體積(ji)(ji)>1μL ）顯著(zhu)增加 |
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可以與其他(ta)的方法聯用 |
UHPLC兼容高溫(wen)LC，2D-LC或者核(he)殼色譜(pu)柱（單一(yi)或者組(zu)合聯用(yong)）。這些都(dou)是可選項，而不是“有(you)它(ta)就(jiu)不能有(you)它(ta)”。 |
與傳統的(de)(de)(de)HPLC相比，UHPLC具有分(fen)析速度快(kuai)的(de)(de)(de)優勢，圖2闡述了一種藥物分(fen)析由HPLC方法轉(zhuan)移為(wei)UHPLC方法的(de)(de)(de)譜(pu)圖對比。從HPLC到UHPLC，根據幾何尺寸按比例(li)縮放(fang)色譜(pu)柱及操作參數(shu),可以在相同分(fen)辨率的(de)(de)(de)情(qing)(qing)況下將(jiang)分(fen)析時間減少10倍，這并不罕見(jian)。“保證好的(de)(de)(de)分(fen)辨率的(de)(de)(de)情(qing)(qing)況下進行更(geng)快(kuai)的(de)(de)(de)分(fen)析”這是大(da)多數(shu)用戶(hu)考慮購買(mai)更(geng)昂(ang)貴的(de)(de)(de)UHPLC設備的(de)(de)(de)主要誘(you)因。
UHPLC的(de)(de)(de)另一(yi)個重(zhong)要的(de)(de)(de)好處是(shi)其(qi)對復雜樣(yang)品優秀的(de)(de)(de)分(fen)離(li)(li)能力(li)。這(zhe)方面常常被忽視,在(zai)文獻中也(ye)很(hen)少報(bao)道。在(zai)合(he)理的(de)(de)(de)時間跨度(~1 h)內，400至(zhi)1000范圍(wei)內的(de)(de)(de)峰(feng)容(rong)(rong)量(PC)已經通(tong)(tong)過(guo)使(shi)用UHPLC來(lai)證實(shi)。峰(feng)容(rong)(rong)量是(shi)分(fen)辨率為(wei)(wei)1.0時，色譜(pu)(pu)圖(tu)上可(ke)以(yi)分(fen)辨的(de)(de)(de)色譜(pu)(pu)峰(feng)個數(shu)；通(tong)(tong)常傳統的(de)(de)(de)HPLC為(wei)(wei)200左右。有(you)史以(yi)來(lai)第(di)一(yi)次,UHPLC可(ke)以(yi)在(zai)單一(yi)維度,對復雜的(de)(de)(de)藥品、天然(ran)材料、和其(qi)他困(kun)難樣(yang)品基質提(ti)供更有(you)效(xiao)的(de)(de)(de)分(fen)析。圖(tu)3a和3b通(tong)(tong)過(guo)兩(liang)個應用 (植(zhi)物(wu)提(ti)取(qu)物(wu)和胰蛋白酶的(de)(de)(de)消化蛋白質)來(lai)說明Pc>300時，當前UHPLC的(de)(de)(de)高分(fen)辨分(fen)離(li)(li)能力(li)。
UHPLC的(de)(de)其他優勢包括(kuo)溶劑節省(5-15倍),增強的(de)(de)質量(liang)靈敏度(3-10倍)，以及在(zai)保留時間(2–3倍)和峰面積(<0.1%RSD)方(fang)面的(de)(de)卓越性(xing)能。注意，有(you)關(guan)UHPLC中UV檢測靈敏度增加(jia)(jia)的(de)(de)報(bao)告往往會產生誤導(dao),因(yin)為質量(liang)敏感度(分析物注入量(liang))主要與(yu)柱的(de)(de)空隙體積有(you)關(guan)。通(tong)(tong)常(chang)，UHPLC不(bu)(bu)會增加(jia)(jia)濃度靈敏度(最理想的(de)(de)一(yi)種靈敏度),因(yin)為我們不(bu)(bu)能希望使用小的(de)(de)流(liu)通(tong)(tong)池(chi)來增加(jia)(jia)信(xin)噪比，除(chu)非(fei)延長流(liu)通(tong)(tong)池(chi)的(de)(de)路(lu)徑長度 (如(ru)60毫米(mi))。泵混(hun)(hun)合而導(dao)致(zhi)的(de)(de)粘性(xing)發熱、基線擾動以及方(fang)法轉移(yi)等潛在(zai)問(wen)(wen)題已經有(you)文獻描述，而且這些(xie)問(wen)(wen)題分別也是(shi)與(yu)特定的(de)(de)儀器相(xiang)關(guan)聯的(de)(de)。一(yi)般來說(shuo),這些(xie)技術(shu)問(wen)(wen)題已經研究得比較清楚了，而且通(tong)(tong)過(guo)選(xuan)擇合適的(de)(de)系統配(pei)置(zhi)(如(ru)混(hun)(hun)合器體積)能夠很容易(yi)地減輕。但是(shi), 由于培訓、與(yu)驗證數據系統的(de)(de)兼(jian)容性(xing)和其他方(fang)法轉移(yi)的(de)(de)問(wen)(wen)題，UHPLC在(zai)QC實驗室的(de)(de)應用仍然比較浪費時間。
圖2 以商業制藥(yao)配方(fang)(Rapidocain) 質量控制分析為(wei)例(li)：從(cong)傳統(tong)的(de)HPLC到UHPLC使用幾何比例(li)縮放。峰(feng)識別:1:對(dui)羥基(ji)苯甲(jia)酸甲(jia)酯(zhi)(zhi),2:2、6-二(er)甲(jia)基(ji)苯胺,3:尼泊金丙酯(zhi)(zhi),4:利多卡(ka)因(yin)。HPLC條(tiao)件(jian):色譜柱(zhu)(zhu)RP18 150 x4.6毫米(mi),5μm, F=1ml/min, Vinj=20μL。UHPLC條(tiao)件(jian): 色譜柱(zhu)(zhu)RP18 x2.1 50毫米(mi),1.7μm,F = 600μL /min,Vinj = 1.4μL。超快UHPLC條(tiao)件(jian):色譜柱(zhu)(zhu)RP18 x2.1 50毫米(mi),1.7μm,F = 1000μL /min,Vinj =1.4μL[16]。
我們(men)經常聽到(dao)一些爭(zheng)論，UHPLC也(ye)許并(bing)不(bu)需要(yao),因為其(qi)他方法(高溫(wen)LC、核殼柱子或二維(wei)LC)可以更合算的(de)提高速度或分辨率。這種推理并(bing)不(bu)是(shi)真實(shi)有根據的(de)，因為與傳(chuan)統(tong)的(de)HPLC相(xiang)比，UHPLC在使用過程會中可以與一個(ge)(ge)(ge)或多個(ge)(ge)(ge)以上的(de)這些方法聯用獲得更出色的(de)結果。這些方法都是(shi)可選項(xiang),而不(bu)是(shi)“有它(ta)就(jiu)不(bu)能有它(ta)”。此外,“UHPLC”這個(ge)(ge)(ge)詞語可能在幾年內(nei)最終消失，因為所(suo)有新的(de)HPLC都是(shi)UHPLC了。
HPLC色譜柱和固定相的發展
HPLC色(se)譜(pu)柱(zhu)是(shi)色(se)譜(pu)系統的(de)(de)(de)核心。在堿性分(fen)析物(wu)分(fen)析方面(mian)(mian)(mian)，制(zhi)藥業一(yi)直是(shi)HPLC色(se)譜(pu)柱(zhu)向高(gao)(gao)速、高(gao)(gao)分(fen)辨率(lv)、更好(hao)的(de)(de)(de)峰形發(fa)展的(de)(de)(de)主(zhu)要(yao)驅動力。此外,QC實驗室已(yi)經被要(yao)求(qiu)改進色(se)譜(pu)柱(zhu)的(de)(de)(de)批次(ci)重現(xian)性。從70年(nian)代到90年(nian)代,在填充材(cai)料的(de)(de)(de)標(biao)準(zhun)顆粒(li)尺度(10-3μm)的(de)(de)(de)逐級(ji)縮小方面(mian)(mian)(mian)已(yi)經有穩定的(de)(de)(de)改進。80年(nian)代后期，高(gao)(gao)純(chun)度B型(xing)硅材(cai)料(低金(jin)屬含(han)量)的(de)(de)(de)引入是(shi)一(yi)個巨大(da)進步,減少了硅醇(chun)的(de)(de)(de)活性，并(bing)在批次(ci)間的(de)(de)(de)一(yi)致性方面(mian)(mian)(mian)有重大(da)改進。現(xian)在高(gao)(gao)純(chun)硅的(de)(de)(de)使用(yong)是(shi)所有現(xian)代硅膠基質色(se)譜(pu)柱(zhu)的(de)(de)(de)標(biao)準(zhun)。
圖3 UHPLC 高分(fen)辨率分(fen)離(C18色(se)譜柱，填充亞2μm顆粒)。(A)銀(yin)杏標(biao)準化(hua)提取物的(de)色(se)譜圖。梯(ti)度(du)：5%到40%的(de)乙腈，120分(fen)鐘(zhong)，T=30°C, Lcol = 300mm，F = 0.2 mL/min,ΔPmax = 860 bar,峰(feng)容(rong)量可(ke)(ke)以達到360；(B)三種(zhong)蛋(dan)白質的(de)結合胰蛋(dan)白酶消化(hua)酶的(de)色(se)譜圖。梯(ti)度(du)：5%到60%的(de)乙腈，120min ，T=30°C，Lcol = 40cm,F = 0.16 mL/min,ΔPmax = 940bar,峰(feng)容(rong)量可(ke)(ke)以達到410。
HPLC色(se)譜柱(zhu)技術的近(jin)期進展(zhan)已經被廣泛地綜述(已經有很多文(wen)獻綜述并討論了HPLC的色(se)譜柱(zhu)技術的近(jin)期進展(zhan))。表2總結了重(zhong)大行業使(shi)用率(lv)較高(gao)的，用于提高(gao)生產力(li)、穩(wen)定性、選擇(ze)性或(huo)保(bao)留時間(亞2μm,核殼粒子,混合(he)物,新奇的鍵合(he)反應,HILIC)或(huo)專(zhuan)業應用 (手(shou)性化合(he)物或(huo)生物分子)的色(se)譜柱(zhu)。
表2 影響藥物分析的重(zhong)要的HPLC色譜柱的研(yan)究進展
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HPLC色譜柱重要研究進展 |
評論 |
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亞2μm顆粒 |
全孔亞2μm顆粒產生較(jiao)低的塔(ta)板高(gao)度(du)和高(gao)的塔(ta)板效率。10多家供應商提供超過80種(zhong)可用(yong)的化(hua)學反應，包括(kuo)離子交換(huan)、尺(chi)寸(cun)排(pai)阻等。 |
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亞3μm核殼顆粒 |
表(biao)面多孔型亞-3μm顆粒(li)在(zai)低柱壓條件下提供改善的(de)質量(liang)傳遞和較低的(de)塔板高度。增(zeng)加(jia)了(le)在(zai)藥物(wu)分析中(zhong)的(de)使用案例。 |
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混合硅顆粒 |
創新的顆粒提高色譜柱(zhu)的化學穩定性（擴大pH范圍、溫(wen)度和壓力性能，親硅(gui)醇(chun)基活性） |
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新(xin)奇的鍵合化學反應 |
多官能團的硅烷化學、極性嵌入式鍵(jian)合(he)相(xiang)、五氟(fu)苯酚（PFP）、 苯基(ji)-己基(ji)、表面(mian)帶(dai)電雜(za)化（CSH）相(xiang)，提供“正交”分(fen)離和(he)增強的選(xuan)擇性（與傳統的C18鍵(jian)合(he)相(xiang)相(xiang)比） |
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親水(shui)作(zuo)用色譜（HILIC） |
反相色譜的“正交”分離對強極性化合物(wu)和次生代謝物(wu)有(you)用 |
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用于手性分離(li)的(de)多(duo)糖(tang)固定相(xiang) |
多糖手性固定(ding)相使得通常的色譜(pu)柱(zhu)具有多用(yong)性和抗造性 |
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生物(wu)分子色譜(pu)柱 |
創新的(de)核殼結構和(he)UHPLC大孔徑固定相(xiang)可以有效改善蛋白質和(he)治療性生(sheng)物分(fen)子(zi)（如(ru)mAbs）的(de)分(fen)析。 |
亞2 μm顆粒
1956年，Van Deemter就給出了使用非常小(xiao)(xiao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)顆粒(li)(li)(li)(li)進行快速、高效分(fen)(fen)離的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)預測(ce)。在過去五年中(zhong)，典型填(tian)(tian)料的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)粒(li)(li)(li)(li)徑(jing)(jing)在不(bu)斷的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)減小(xiao)(xiao)，二十(shi)一世紀初，集中(zhong)在亞2μm的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)硅微顆粒(li)(li)(li)(li)。正(zheng)如預測(ce)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)那樣,這(zhe)些粒(li)(li)(li)(li)子(zi)(例如,1.7μm)產生(sheng)卓(zhuo)越(yue)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)性(xing)(xing)能(~ 280000 plates/m或~ 4μm/plate)。然(ran)而,填(tian)(tian)充亞2μm粒(li)(li)(li)(li)子(zi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)色(se)譜(pu)柱(zhu)產生(sheng)高的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)背(bei)壓，通(tong)常填(tian)(tian)充內徑(jing)(jing)為(wei)2.1毫(hao)米(mi)，通(tong)過粘性(xing)(xing)發熱減少效率損(sun)失。對高壓力和低分(fen)(fen)散(減少附加柱(zhu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)譜(pu)帶展(zhan)寬)系統的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)要求導致了現代UHPLC系統的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)當前特(te)點。進一步降(jiang)低粒(li)(li)(li)(li)徑(jing)(jing)至小(xiao)(xiao)于1.5μm可能會(hui)產生(sheng)更高的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)速度(du)和性(xing)(xing)能。然(ran)而,它也必須(xu)伴隨(sui)著系統壓力的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)大幅增(zeng)加和毛細(xi)管色(se)譜(pu)柱(zhu)內徑(jing)(jing)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)減小(xiao)(xiao)。
核殼結構顆粒
Kirkland第一次描述了(le)熔(rong)融(rong)的(de)(de)(de)(de)核或者核殼粒子(zi)的(de)(de)(de)(de)概念，減(jian)少質量轉移過程中的(de)(de)(de)(de)阻力。第一個(ge)核殼粒子(zi)具有如下特點(dian):2.7μm表面多(duo)孔(kong)硅(gui)材(cai)料，無(wu)孔(kong)的(de)(de)(de)(de)核心(1.7μm)，多(duo)孔(kong)的(de)(de)(de)(de)殼層(厚0.5μm)。這(zhe)些亞3 μm的(de)(de)(de)(de)顆粒與(yu)亞2μm的(de)(de)(de)(de)完(wan)全多(duo)孔(kong)材(cai)料相(xiang)(xiang)比(bi)似乎具有相(xiang)(xiang)似的(de)(de)(de)(de)效率，但是(shi)可(ke)(ke)以產生更低的(de)(de)(de)(de)壓降。這(zhe)種(zhong)特殊的(de)(de)(de)(de)性能可(ke)(ke)能是(shi)由(you)于殼體較短的(de)(de)(de)(de)擴散路徑，或者比(bi)較狹窄的(de)(de)(de)(de)填(tian)料分(fen)布。由(you)于快速分(fen)離(HIS、IPC和清潔驗證)和在(zai)生物分(fen)子(zi)方面的(de)(de)(de)(de)應用(yong)，核殼色(se)譜(pu)柱迅速獲得廣泛的(de)(de)(de)(de)接受。越來越多(duo)的(de)(de)(de)(de)制造商(shang)可(ke)(ke)以提供各種(zhong)鍵合相(xiang)(xiang)和不同尺寸的(de)(de)(de)(de)粒子(zi)(1.3,1.7,2.6,1.3和5μm)。我們完(wan)全相(xiang)(xiang)信，與(yu)多(duo)孔(kong)微細顆粒的(de)(de)(de)(de)色(se)譜(pu)柱相(xiang)(xiang)比(bi)，這(zhe)些色(se)譜(pu)柱在(zai)所(suo)有應用(yong)中具有很大的(de)(de)(de)(de)競爭力。
圖4 10種(zhong)具有酸(suan)性(xing)、堿性(xing)和(he)中性(xing)官能團(tuan)的(de)商品化藥物(wu)(wu)在BEH和(he)CSH分析(xi)柱的(de)分析(xi)比(bi)較，梯(ti)度洗(xi)脫，流動相含(han)乙(yi)腈和(he)0.1%的(de)甲酸(suan)。峰1、4、6和(he)8是(shi)基(ji)本藥物(wu)(wu)。從文獻中復印,已(yi)取得許(xu)可(ke)。
雜化
將有(you)(you)機基(ji)(ji)團(tuan)引(yin)入到無(wu)機硅基(ji)(ji)體中形(xing)成雜交顆粒的(de)(de)理念(nian)在(zai)上世紀70年(nian)代首次由(you)Unger提出，雖然第一(yi)根具有(you)(you)甲基(ji)(ji)基(ji)(ji)團(tuan)的(de)(de)商業化(hua)的(de)(de)色譜柱(zhu)在(zai)1999年(nian)才正式推(tui)出。這些(xie)混合(he)物中的(de)(de)鍵合(he)相被證明(ming)具有(you)(you)很好的(de)(de)pH穩定(ding)性(具有(you)(you)新奇的(de)(de)鍵合(he)化(hua)學反應的(de)(de)pH范圍為(wei)(wei)1到12,而傳統(tong)的(de)(de)具有(you)(you)常規(gui)單功(gong)能鍵合(he)硅顆粒的(de)(de)pH范圍為(wei)(wei)2-8),低的(de)(de)親硅羥基(ji)(ji)活性。2005年(nian)，引(yin)入第二代橋聯乙(yi)烯雜化(hua) (BEH)，并立即獲得了“主流(liu)”成功(gong),特別是高pH值(zhi)流(liu)動(dong)相以及(ji)UHPLC的(de)(de)應用方面。
新奇的鍵合反應
或(huo)許是因為批次之(zhi)間重現(xian)性(xing)(xing)最好(hao),傳統的(de)(de)(de)單(dan)官能團的(de)(de)(de)C18硅膠基(ji)質鍵合(he)(he)(he)相仍是主(zhu)要(yao)的(de)(de)(de)產品,但是新(xin)的(de)(de)(de)鍵合(he)(he)(he)化學反(fan)應給困難的(de)(de)(de)分(fen)離(li)(極性(xing)(xing)嵌入式、苯(ben)(ben)基(ji)、己基(ji)苯(ben)(ben)基(ji)、含氰基(ji)的(de)(de)(de)、戊烷(wan)氟苯(ben)(ben)基(ji)鍵合(he)(he)(he))帶來了(le)更寬的(de)(de)(de)pH值(zhi)穩定(ding)(ding)范(fan)圍(多官能的(de)(de)(de)硅烷(wan)化學鍵或(huo)異(yi)丙基(ji)保(bao)(bao)護的(de)(de)(de)硅烷(wan))和增(zeng)(zeng)強的(de)(de)(de)選擇性(xing)(xing)。最近的(de)(de)(de)一個創新(xin)方(fang)法稱為表面(mian)帶電(dian)雜化(CSH)技術(shu)(shu)，該項(xiang)技術(shu)(shu)于(yu)2010年引(yin)入,由(you)于(yu)在(zai)酸性(xing)(xing),低離(li)子(zi)(zi)強度流(liu)(liu)動相條(tiao)件下，對高(gao)(gao)堿性(xing)(xing)分(fen)析物(wu)(wu)的(de)(de)(de)峰(feng)形的(de)(de)(de)改善(shan)，該項(xiang)技術(shu)(shu)立即在(zai)藥(yao)物(wu)(wu)分(fen)析領(ling)域獲得了(le)很好(hao)的(de)(de)(de)接受(shou)(shou)度(如0.1%甲酸)。這項(xiang)專(zhuan)有(you)(you)技術(shu)(shu)包(bao)括(kuo)在(zai)固定(ding)(ding)相表面(mian)引(yin)入低水平的(de)(de)(de)正電(dian)荷。這類似于(yu)早期在(zai)流(liu)(liu)動相中添加(jia)有(you)(you)機(ji)胺，如三乙胺，但由(you)于(yu)離(li)子(zi)(zi)抑制(zhi)，已經不被LC/MS接受(shou)(shou)。圖4說明了(le)與(yu)現(xian)在(zai)的(de)(de)(de)鍵合(he)(he)(he)相相比，CSH顆粒在(zai)峰(feng)形方(fang)面(mian)表現(xian)的(de)(de)(de)優勢。注意,酸性(xing)(xing)化合(he)(he)(he)物(wu)(wu)在(zai)CSH柱子(zi)(zi)上會有(you)(you)相對較高(gao)(gao)的(de)(de)(de)保(bao)(bao)留，峰(feng)拖尾現(xian)象也會有(you)(you)所增(zeng)(zeng)加(jia)。
親水作用色譜(HILIC)
在(zai)反相(xiang)(xiang)(xiang)(xiang)LC(RPLC)條件下，若流動相(xiang)(xiang)(xiang)(xiang)中有(you)機物含(han)量(liang)比(bi)較低(di)，就會導(dao)致相(xiang)(xiang)(xiang)(xiang)坍塌(ta)現象(鍵(jian)合相(xiang)(xiang)(xiang)(xiang)脫(tuo)水)，許多強極性(xing)化(hua)合物就無法(fa)獲得足夠(gou)的保留時間(jian)或者會存在(zai)問題。HILIC模(mo)式, 90年代由Alpert首次(ci)開發,使(shi)(shi)用親(qin)水固定相(xiang)(xiang)(xiang)(xiang)(硅(gui)、二(er)醇、氰基(ji)(ji)、氨(an)基(ji)(ji)、兩性(xing)離子的)，類似RPLC使(shi)(shi)用的水緩沖和乙(yi)腈(jing)流動相(xiang)(xiang)(xiang)(xiang),在(zai)極性(xing)藥物分析、輔助藥物代謝、氨(an)基(ji)(ji)酸(suan)、多肽(tai)、神經遞質、低(di)聚糖、碳水化(hua)合物、核苷酸(suan)或核苷方面(mian)的分析中越來越受歡迎。HILIC實際(ji)的保留機制可(ke)以(yi)認為是分析物分子“分區”到附著在(zai)親(qin)水結(jie)合基(ji)(ji)團的水層(ceng)。與RPLC相(xiang)(xiang)(xiang)(xiang)比(bi)，HILIC其(qi)他突出的優(you)勢(shi)包括“正交”選(xuan)擇性(xing)(樣品制備(bei)兼容兩種模(mo)式),對質譜具(ju)有(you)更高的電噴霧離子化(hua)靈敏度(du)(5-15倍),較低(di)的操作壓力(li)。
固定化多糖手性固定相
成功(gong)包覆的(de)(de)多(duo)糖手性固定(ding)相(CSPs)的(de)(de)改進版本在2000年代末實現。與早期的(de)(de)CSPs具(ju)有相似的(de)(de)多(duo)功(gong)能，但(dan)是對于腐蝕性的(de)(de)溶劑具(ju)有更好的(de)(de)穩定(ding)性劑,可(ke)用(yong)于正相,極性有機和反相模式。
用于生(sheng)物(wu)分子的色(se)譜柱(zhu)
80年代發展起(qi)來的(de)(de)(de)大(da)(da)孔徑硅和(he)(he)聚合(he)物(wu)填(tian)料可有效解決(jue)大(da)(da)型生物(wu)分子的(de)(de)(de)分離(li)。隨著(zhu)重組蛋白，如(ru)單(dan)克隆抗體(ti)(mAb)等生物(wu)制(zhi)藥(yao)的(de)(de)(de)出現，質(zhi)量控制(zhi)中(zhong)利(li)用HPLC和(he)(he)毛細(xi)管電泳進(jin)行詳細(xi)表征的(de)(de)(de)需求變得更加緊迫。最近，亞2μm微粒和(he)(he)核殼大(da)(da)孔徑顆粒以及(ji)一些創(chuang)新(xin)的(de)(de)(de)離(li)子交換和(he)(he)尺寸排(pai)阻等材料也(ye)被證明可以有效的(de)(de)(de)分離(li)這(zhe)些大(da)(da)分子的(de)(de)(de)生物(wu)制(zhi)劑(ji)。
高分辨率質譜(HRMS)，電霧式檢測器(CAD)和自動方法開發系統(AMDS)
在(zai)(zai)過去十年中，其他具(ju)有(you)高影(ying)響力的進展主要(yao)體現在(zai)(zai)HPLC檢測和自動化(hua)領域。
高分辨率質譜(HRMS)
HPLC與質(zhi)譜(pu)的(de)聯用(LC / MS)，集(ji)合了HPLC的(de)分離能(neng)力和(he)質(zhi)譜(pu)卓越(yue)的(de)靈(ling)敏度和(he)選(xuan)擇性(xing)，已被視為完美的(de)分析(xi)(xi)工具。LC/MS是(shi)雜(za)質(zhi)和(he)降解鑒(jian)定(ding),藥(yao)(yao)物(wu)(wu)研(yan)究(jiu)中(zhong)的(de)高(gao)通(tong)量篩選(xuan)技(ji)術(shu)(HTS),生(sheng)物(wu)(wu)分析(xi)(xi)試驗(生(sheng)物(wu)(wu)流體中(zhong)藥(yao)(yao)物(wu)(wu)和(he)代謝(xie)物(wu)(wu)的(de)LC/MS/MS檢測),藥(yao)(yao)物(wu)(wu)合成工藝(yi)放大(da)在線監測的(de)首選(xuan)技(ji)術(shu)。LC/MS已經成為高(gao)效藥(yao)(yao)物(wu)(wu)清(qing)潔驗證以及潛在的(de)基因毒性(xing)雜(za)質(zhi)測定(ding)的(de)標(biao)準(zhun)技(ji)術(shu)平(ping)臺。過去(qu)十(shi)年(nian)中(zhong)，HRMS(如(ru)TOF、OrbiTrap MS)和(he)雜(za)化質(zhi)譜(pu)(如(ru)Quadrupole-TOF或(huo)ion trap-OrbiTrap)得到(dao)了快速(su)發展。HRMS和(he)UHPLC以及二維LC的(de)聯用使得代謝(xie)組學、蛋(dan)白(bai)質(zhi)組學, De Novo蛋(dan)白(bai)測序和(he)生(sheng)物(wu)(wu)制藥(yao)(yao)表(biao)征等(deng)領域的(de)研(yan)究(jiu)愈發活躍。新興的(de)個性(xing)化醫療(liao)領域中(zhong)生(sheng)物(wu)(wu)標(biao)志物(wu)(wu)測定(ding)和(he)疾病(bing)診斷(duan)的(de)通(tong)用技(ji)術(shu)平(ping)臺也許(xu)是(shi)LC/MS最(zui)令人興奮的(de)機會。
電(dian)霧式檢測器(CAD)
缺乏理想的(de)(de)通用檢(jian)(jian)(jian)測器(qi)常(chang)常(chang)被視為(wei)HPLC的(de)(de)局(ju)限,盡管UV/Vis檢(jian)(jian)(jian)測器(qi)可以(yi)檢(jian)(jian)(jian)測具有(you)發(fa)色(se)基團的(de)(de)化合(he)物(wu)。示差折光(guang)檢(jian)(jian)(jian)測器(qi)不適(shi)合(he)梯度洗脫，敏感性不夠(gou)。蒸發(fa)光(guang)散射(she)檢(jian)(jian)(jian)測器(qi)(ELSD)使用噴霧器(qi)技術與激光(guang)光(guang)散射(she)檢(jian)(jian)(jian)測，是(shi)HPLC的(de)(de)一個選擇，也可以(yi)兼(jian)容梯度洗脫,但(dan)最近已經被CAD(使用噴霧器(qi)和(he)電(dian)暈放電(dian)檢(jian)(jian)(jian)測技術)超越(yue),CAD可以(yi)提供更(geng)好的(de)(de)靈敏度(低至ng)和(he)更(geng)好的(de)(de)線性。CAD正逐漸成為(wei)藥物(wu)化學中(zhong)的(de)(de)HTS、反應(ying)過(guo)程監(jian)控以(yi)及原材料/輔料測試的(de)(de)主(zhu)流的(de)(de)檢(jian)(jian)(jian)測器(qi)。
自動(dong)化HPLC方法體(ti)系(AMDS)
復(fu)雜(za)混合物(wu)(wu)的(de)(de)(de)(de)(de)HPLC方(fang)(fang)(fang)(fang)法開發是一(yi)(yi)個(ge)很耗(hao)時的(de)(de)(de)(de)(de)工作，因為需要優(you)化很多操作參數(shu)(柱(zhu)尺(chi)寸(cun)，鍵合固定(ding)相(xiang)和(he)(he)流(liu)動(dong)相(xiang)A和(he)(he)B(有(you)機溶劑/緩沖類型(xing)、pH值和(he)(he)離(li)子強度(du)(du))的(de)(de)(de)(de)(de)類型(xing),梯(ti)度(du)(du)洗(xi)脫時間(jian)(jian)和(he)(he)梯(ti)度(du)(du)范圍(wei),柱(zhu)溫度(du)(du)、流(liu)量(liang))。一(yi)(yi)個(ge)常見的(de)(de)(de)(de)(de)例(li)子就(jiu)是藥(yao)物(wu)(wu)活(huo)性(xing)成分(fen)(fen)(API)穩定(ding)性(xing)指示分(fen)(fen)析或純(chun)(chun)度(du)(du)測定(ding)，其中(zhong)所有(you)的(de)(de)(de)(de)(de)雜(za)質(zhi)和(he)(he)降解產物(wu)(wu)必須分(fen)(fen)離(li)，通(tong)過UV檢測器進(jin)行(xing)準確的(de)(de)(de)(de)(de)定(ding)量(liang)。多年以來(lai)(lai)，基于模擬、預測、單純(chun)(chun)形優(you)化、柱(zhu)/流(liu)動(dong)相(xiang)篩(shai)選的(de)(de)(de)(de)(de)軟件或自(zi)動(dong)化系統(tong)已(yi)經(jing)促進(jin)HPLC方(fang)(fang)(fang)(fang)法的(de)(de)(de)(de)(de)開發。雖(sui)然他們(men)似乎還(huan)沒(mei)有(you)很普及，但持續(xu)的(de)(de)(de)(de)(de)改進(jin)提高了(le)HPLC的(de)(de)(de)(de)(de)性(xing)能(neng)和(he)(he)易用(yong)(yong)性(xing)。最新進(jin)入(ru)市場的(de)(de)(de)(de)(de)是一(yi)(yi)個(ge)附(fu)加軟件包，兼容兩個(ge)常用(yong)(yong)的(de)(de)(de)(de)(de)色譜數(shu)據系統(tong)。對(dui)于HPLC方(fang)(fang)(fang)(fang)法開發過程(優(you)化)中(zhong)最耗(hao)時的(de)(de)(de)(de)(de)部分(fen)(fen)，該(gai)(gai)軟件利(li)用(yong)(yong)用(yong)(yong)戶(hu)定(ding)義(yi)空(kong)間(jian)(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)自(zi)動(dong)化序(xu)列方(fang)(fang)(fang)(fang)法來(lai)(lai)解決(jue)，其中(zhong)使(shi)用(yong)(yong)了(le)實(shi)驗(yan)設(she)計(DoE)和(he)(he)質(zhi)量(liang)源于設(she)計(QbD)的(de)(de)(de)(de)(de)原(yuan)(yuan)則(ze)。導入(ru)完整的(de)(de)(de)(de)(de)序(xu)列結果之(zhi)后(hou)，該(gai)(gai)軟件還(huan)可(ke)以執行(xing)統(tong)計分(fen)(fen)析，并顯示最佳(jia)條(tiao)件。圖5說(shuo)明了(le)應用(yong)(yong)在我們(men)實(shi)驗(yan)室(shi)的(de)(de)(de)(de)(de)該(gai)(gai)軟件的(de)(de)(de)(de)(de)概念和(he)(he)特征。自(zi)DoE 和(he)(he) QbD概念被接(jie)(jie)受以來(lai)(lai),最初用(yong)(yong)戶(hu)表現出(chu)很高的(de)(de)(de)(de)(de)興趣。AMDS對(dui)致力于早期藥(yao)物(wu)(wu)開發方(fang)(fang)(fang)(fang)法的(de)(de)(de)(de)(de)實(shi)驗(yan)室(shi)特別有(you)用(yong)(yong)。例(li)如(ru),為了(le)支(zhi)持利(li)用(yong)(yong)多手(shou)(shou)性(xing)中(zhong)心的(de)(de)(de)(de)(de)復(fu)雜(za)藥(yao)物(wu)(wu)分(fen)(fen)子進(jin)行(xing)API合成和(he)(he)藥(yao)物(wu)(wu)產品制造,10-20種具(ju)有(you)代表性(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)HPLC方(fang)(fang)(fang)(fang)法(原(yuan)(yuan)材料(liao)、起始(shi)物(wu)(wu)料(liao)、中(zhong)間(jian)(jian)體、最終的(de)(de)(de)(de)(de)原(yuan)(yuan)料(liao)藥(yao)和(he)(he)藥(yao)物(wu)(wu)產品的(de)(de)(de)(de)(de)非(fei)手(shou)(shou)性(xing)和(he)(he)手(shou)(shou)性(xing)方(fang)(fang)(fang)(fang)法,)接(jie)(jie)二連三地被開發出(chu)來(lai)(lai)。
圖5 一(yi)個全自動方法開發系統的儀器構(gou)造(zao)圖解，該系統使用QbD軟(ruan)件和所(suo)得結果的圖形，顯示最佳(jia)分離(白色)的操作范(fan)圍(wei)設計空間。
結論
總(zong)之, 最(zui)(zui)(zui)近幾年中，HPLC仍然是(shi)(shi)一(yi)個高(gao)度(du)有(you)活力的(de)領域(yu)，在儀器、色譜(pu)柱技(ji)術、應用等方(fang)面(mian)有(you)很多創新。醫藥(yao)科學(xue)家(jia)們最(zui)(zui)(zui)初將這(zhe)些新技(ji)術應用于研(yan)究(jiu)、開(kai)發(fa)和(he)質量控制，他們是(shi)(shi)這(zhe)項技(ji)術的(de)早期采納者(zhe)，同時也是(shi)(shi)受(shou)益者(zhe)。UHPLC在研(yan)究(jiu)與(yu)(yu)開(kai)發(fa)領域(yu)被快速(su)的(de)接受(shou)，并逐漸成(cheng)為標準的(de)UHPLC平臺，雖然在QC實驗(yan)室的(de)應用速(su)度(du)慢一(yi)些。新的(de)色譜(pu)柱技(ji)術可(ke)以更(geng)快和(he)更(geng)有(you)效的(de)分析復雜樣品、手性分子和(he)生(sheng)物(wu)分子。最(zui)(zui)(zui)后(hou),UHPLC和(he)2-D LC與(yu)(yu)高(gao)分辨率質譜(pu)聯用技(ji)術的(de)快速(su)進展(zhan)(zhan)，已經徹底改(gai)變了生(sheng)命科學(xue)的(de)研(yan)究(jiu)，并將會在臨床診斷方(fang)面(mian)產生(sheng)更(geng)大的(de)影響。這(zhe)些進展(zhan)(zhan)得到了在快速(su)發(fa)展(zhan)(zhan)的(de)藥(yao)物(wu)開(kai)發(fa)領域(yu)工作的(de)分析化學(xue)家(jia)的(de)歡迎。
對于LC在(zai)接下來的(de)(de)(de)(de)(de)幾年的(de)(de)(de)(de)(de)發展前景,一(yi)些創新(xin)的(de)(de)(de)(de)(de)工作已(yi)經被描述。就(jiu)像Jim Jorgenson描述的(de)(de)(de)(de)(de):“更高(gao)的(de)(de)(de)(de)(de)壓力(li)(50000 psi)將使更小的(de)(de)(de)(de)(de)顆粒和/或更長的(de)(de)(de)(de)(de)色譜柱(zhu)(zhu)的(de)(de)(de)(de)(de)使用成為可(ke)(ke)能(neng),同時分(fen)離速(su)度(du)更快，效果(guo)也更好(hao)。由(you)于熱量的(de)(de)(de)(de)(de)產生和耗(hao)散問題，幾乎肯定的(de)(de)(de)(de)(de)是(shi)需要使用sub-mm孔(毛細管)色譜柱(zhu)(zhu)。這(zhe)并不是(shi)一(yi)件容易的(de)(de)(de)(de)(de)事情,但是(shi)高(gao)速(su)、高(gao)分(fen)辨率分(fen)離方(fang)面(mian)潛在(zai)的(de)(de)(de)(de)(de)可(ke)(ke)能(neng)性是(shi)誘人(ren)的(de)(de)(de)(de)(de)。”另外,在(zai)毛細管中填充極其均一(yi)的(de)(de)(de)(de)(de)次微米二氧化硅粒子可(ke)(ke)以用來產生遠低于1μm的(de)(de)(de)(de)(de)塔板(ban)高(gao)度(du)，并能(neng)對蛋(dan)白質變異體進行令人(ren)印象(xiang)深(shen)刻的(de)(de)(de)(de)(de)分(fen)離。這(zhe)兩(liang)個研究(jiu)結(jie)果(guo)還(huan)沒有準備好(hao)馬(ma)上成為主流分(fen)析工作或QC，但是(shi)第一(yi)個結(jie)果(guo)是(shi)鼓舞人(ren)心的(de)(de)(de)(de)(de),因此(ci)在(zai)這(zhe)里(li)值得(de)一(yi)提。
原文作者(zhe)：Michael W. Dong, Ph.D.
Davy Guillarme, Ph.D.
