脂肪酸氣相色譜分析的故事

2015-07-17 作(zuo)者：瀏(liu)覽數(shu)：1573

編者(zhe)注：傅(fu)若(ruo)農(nong)教(jiao)授(shou)生(sheng)于(yu)1930年(nian)(nian)，1953年(nian)(nian)畢業(ye)于(yu)北(bei)京(jing)(jing)大學(xue)化學(xue)系，而后一直(zhi)在(zai)北(bei)京(jing)(jing)理工(gong)大學(xue)(原北(bei)京(jing)(jing)工(gong)業(ye)學(xue)院(yuan))從事(shi)教(jiao)學(xue)與科研(yan)工(gong)作。1958年(nian)(nian)，傅(fu)若(ruo)農(nong)教(jiao)授(shou)開始帶領(ling)學(xue)生(sheng)初步進入吸附柱色(se)譜和(he)氣(qi)相(xiang)色(se)譜的探索(suo);1966到1976年(nian)(nian)文(wen)化大革命(ming)的后期(qi)，傅(fu)若(ruo)農(nong)教(jiao)授(shou)在(zai)干校勞動的間(jian)隙(xi)，系統(tong)地閱讀(du)并翻譯了(le)(le)兩本氣(qi)相(xiang)色(se)譜啟蒙(meng)書，從此(ci)進入其(qi)后半生(sheng)一直(zhi)從事(shi)的事(shi)業(ye)——色(se)譜研(yan)究(jiu)。傅(fu)若(ruo)農(nong)教(jiao)授(shou)是(shi)我國老一輩色(se)譜研(yan)究(jiu)專家，見(jian)證了(le)(le)我國氣(qi)相(xiang)色(se)譜研(yan)究(jiu)的發展，為我國培養了(le)(le)眾(zhong)多色(se)譜研(yan)究(jiu)人才。

第一講：傅若農講述氣相色譜技術發展歷史及趨勢

第二講：傅若農：從三家公司GC產品更迭看氣相技術發展

第三講：傅若農：從國產氣相產品看國內氣相發展脈絡及現狀

第四講：傅若農：氣相色譜固定液的前世今生

第五講：傅若農：氣-固色譜的魅力

第六講：傅若農：PLOT氣相色譜柱的誘惑力

第七講：傅若農：酒駕判官——頂空氣相色譜的前世今生

第八講：傅若農：一掃而光——吹掃捕集-氣相色譜的發展

第九講：傅若農：凌空一瞥洞察一切——神通廣大的固相微萃取（SPME）

第十講：傅若農：懸“珠”濟世——單液滴微萃取(SDME)的妙用

第十一講：傅若農：扭轉乾坤——神奇的反應頂空氣相色譜分析

第十二講：擒魔序曲——脂質組學研究中的樣品處理

第十三講：離子液體柱——脂質組學中分離脂肪酸的氣相色譜柱

上(shang)一講我(wo)們主要介紹了(le)在脂(zhi)質組學中對(dui)脂(zhi)肪酸的(de)(de)分(fen)析(xi)所(suo)用(yong)的(de)(de)離子液體毛(mao)細管色(se)譜柱，但是用(yong)氣(qi)相色(se)譜分(fen)析(xi)脂(zhi)肪酸源(yuan)遠流長，有(you)許(xu)多故(gu)事(shi)，了(le)解(jie)(jie)一些過去的(de)(de)故(gu)事(shi)對(dui)現在的(de)(de)發展理解(jie)(jie)有(you)好處，溫故(gu)才可以知(zhi)新。

　　先講(jiang)一下(xia)脂質組學中(zhong)常常要研究的血漿分析，其(qi)中(zhong)一個重要的項目(mu)是分析其(qi)中(zhong)的脂肪酸(suan)，下(xia)面一個例子，概(gai)要介紹了血漿中(zhong)脂肪酸(suan)的主要成分：

　　“雖然游離(li)脂(zhi)(zhi)(zhi)肪(fang)(fang)酸(suan)(suan)(suan)只占血漿(jiang)(jiang)中脂(zhi)(zhi)(zhi)肪(fang)(fang)酸(suan)(suan)(suan)的(de)一(yi)小部分，但(dan)它代(dai)表一(yi)類高度(du)代(dai)謝(xie)活性(xing)的(de)脂(zhi)(zhi)(zhi)質，脂(zhi)(zhi)(zhi)肪(fang)(fang)組(zu)織是血漿(jiang)(jiang)游離(li)脂(zhi)(zhi)(zhi)肪(fang)(fang)酸(suan)(suan)(suan)的(de)主要來源，其分布(bu)與(yu)食物的(de)脂(zhi)(zhi)(zhi)肪(fang)(fang)酸(suan)(suan)(suan)組(zu)成密切相(xiang)(xiang)關。在正常情況下從脂(zhi)(zhi)(zhi)肪(fang)(fang)組(zu)織中釋(shi)放脂(zhi)(zhi)(zhi)肪(fang)(fang)酸(suan)(suan)(suan)與(yu)組(zu)織對能量的(de)需(xu)要緊密相(xiang)(xiang)連。但(dan)是當代(dai)謝(xie)失調時，這(zhe)種平衡被打亂，導致脂(zhi)(zhi)(zhi)解增(zeng)加，會(hui)釋(shi)放出(chu)多于(yu)組(zu)織所需(xu)要脂(zhi)(zhi)(zhi)肪(fang)(fang)酸(suan)(suan)(suan)的(de)量。健康人經過一(yi)夜禁食后血漿(jiang)(jiang)中含有(you)(you)214 nmol/ml游離(li)脂(zhi)(zhi)(zhi)肪(fang)(fang)酸(suan)(suan)(suan)，油(you)酸(suan)(suan)(suan)(18:1)的(de)含量最高，其次是棕櫚酸(suan)(suan)(suan)(16:0)和(he)硬脂(zhi)(zhi)(zhi)酸(suan)(suan)(suan)(18:0)，這(zhe)三種酸(suan)(suan)(suan)占全部游離(li)脂(zhi)(zhi)(zhi)肪(fang)(fang)酸(suan)(suan)(suan)的(de)78%。亞油(you)酸(suan)(suan)(suan)(18:2)和(he)花(hua)生四酸(suan)(suan)(suan)(20:4) 是主要的(de)多不飽(bao)和(he)脂(zhi)(zhi)(zhi)肪(fang)(fang)酸(suan)(suan)(suan)(約(yue)占8%)。但(dan)是有(you)(you)營(ying)養作用的(de)α-亞麻酸(suan)(suan)(suan)(18:3ω-3)，二(er)十碳五烯酸(suan)(suan)(suan)(20:5, EPA)和(he)二(er)十二(er)碳六烯酸(suan)(suan)(suan)(22:6, DHA)也占有(you)(you)一(yi)定比例(li)，約(yue)為全部游離(li)脂(zhi)(zhi)(zhi)肪(fang)(fang)酸(suan)(suan)(suan)的(de)1%。”

1 脂肪酸氣相色譜分析的歷史故事

　　氣(qi)(qi)(qi)相(xiang)(xiang)色(se)譜(pu)被(bei)認為(wei)是分(fen)析復雜混合物中脂(zhi)(zhi)肪(fang)酸(suan)的可靠方(fang)法，這一方(fang)法可追(zhui)述到上(shang)世紀50年代，氣(qi)(qi)(qi)相(xiang)(xiang)色(se)譜(pu)的出現于脂(zhi)(zhi)肪(fang)酸(suan)的分(fen)析有密切的關系，1952年氣(qi)(qi)(qi)相(xiang)(xiang)色(se)譜(pu)發明人A. T. James 和 A. J. P. Martin就用(yong)最為(wei)原始(shi)的自制氣(qi)(qi)(qi)相(xiang)(xiang)色(se)譜(pu)儀分(fen)析小分(fen)子脂(zhi)(zhi)肪(fang)酸(suan)(Biochem J,1952,50:679),他們首次(ci)闡明氣(qi)(qi)(qi)-液分(fen)配氣(qi)(qi)(qi)相(xiang)(xiang)色(se)譜(pu)的原理，設計了自動滴定檢測脂(zhi)(zhi)肪(fang)酸(suan)的氣(qi)(qi)(qi)相(xiang)(xiang)色(se)譜(pu)儀。實驗過程(cheng)中使(shi)用(yong)的色(se)譜(pu)柱為(wei)玻璃柱，其內徑為(wei)4mm，長度為(wei)5英尺，固定相(xiang)(xiang)是把DC 550硅油涂漬在(zai)硅藻土Celite 545上(shang)。分(fen)離小分(fen)子脂(zhi)(zhi)肪(fang)酸(suan)的色(se)譜(pu)如圖(tu)1所示。

圖1 用自動滴定計氣相(xiang)色譜儀(yi)分析(xi)小分子脂肪(fang)酸的色譜圖

　　分離從乙酸(suan)到戊酸(suan)的色(se)譜如圖2所示：

圖 2 分(fen)離從乙酸到戊(wu)酸的(de)色譜

　　此(ci)后分析脂(zhi)(zhi)肪(fang)酸(suan)的一個重(zhong)大進(jin)(jin)步是把脂(zhi)(zhi)肪(fang)酸(suan)進(jin)(jin)行甲酯(zhi)化，1956年James和Martin使用氣體密度檢測器(qi)，并(bing)把脂(zhi)(zhi)肪(fang)酸(suan)進(jin)(jin)行甲酯(zhi)化，使用阿(a)皮松類高溫潤(run)滑脂(zhi)(zhi)作(zuo)固定相，可以分離(li)分子量大的脂(zhi)(zhi)肪(fang)酸(suan)。圖(tu)3 是分離(li)C5-C13直(zhi)鏈和支(zhi)鏈脂(zhi)(zhi)肪(fang)酸(suan)甲酯(zhi)的色譜(pu)圖(tu)。

圖(tu)(tu) 3 用高沸(fei)點潤滑脂分離C5-C13直鏈和支鏈脂肪酸甲酯的色譜(pu)圖(tu)(tu)

色譜柱：在硅藻土載體(ti)上涂漬高沸點潤(run)滑脂；柱溫：197℃；載氣(qi)：氮(dan)氣(qi) 14.1mL/min;

色譜峰: (1) 空氣, (2) n-戊酸(suan)甲(jia)(jia)酯，(3) n-己酸(suan)甲(jia)(jia)酯, (4) 4-甲(jia)(jia)基己酸(suan)甲(jia)(jia)酯,

(5) 6-甲(jia)(jia)基庚酸(suan)甲(jia)(jia)酯, (6) n-辛酸(suan)甲(jia)(jia)酯, (7) 6-甲(jia)(jia)基辛酸(suan)甲(jia)(jia)酯, (8) n-壬酸(suan)甲(jia)(jia)酯,

(9) 8-甲(jia)基(ji)壬酸(suan)酯(zhi)(zhi), (10) n-癸酸(suan)酯(zhi)(zhi), (11) 8-甲(jia)基(ji)癸酸(suan)酯(zhi)(zhi), (12) 10-甲(jia)基(ji)十一酸(suan)酯(zhi)(zhi) ,

（13) n-十(shi)二酸酯, (14) 10-甲基(ji)十(shi)二酸酯

2 脂肪酸氣相色譜分析的發展

　　脂(zhi)(zhi)肪(fang)酸的(de)(de)(de)氣相色(se)譜分析由(you)于它(ta)的(de)(de)(de)極性(xing)(xing)(xing)和(he)(he)揮發性(xing)(xing)(xing)不(bu)好而(er)帶來(lai)麻煩，所以首先要(yao)把它(ta)的(de)(de)(de)極性(xing)(xing)(xing)羰基轉化(hua)成(cheng)易(yi)于揮發的(de)(de)(de)非極性(xing)(xing)(xing)衍(yan)生(sheng)(sheng)物(wu)。有多(duo)種烷基化(hua)試劑(ji)可以進(jin)(jin)行羰基的(de)(de)(de)衍(yan)生(sheng)(sheng)化(hua)，使(shi)用(yong)最(zui)多(duo)的(de)(de)(de)是(shi)進(jin)(jin)行甲基化(hua)，特別(bie)是(shi)使(shi)用(yong)氫火焰(yan)離子(zi)化(hua)監測器(FID)氣相色(se)譜時，尤(you)為(wei)方便普及。但是(shi)使(shi)用(yong)FID也(ye)有一些不(bu)足之處。絕對的(de)(de)(de)定(ding)量(liang)要(yao)依靠內(nei)(nei)(nei)(nei)標物(wu)的(de)(de)(de)信號強度，經常使(shi)用(yong)的(de)(de)(de)內(nei)(nei)(nei)(nei)標物(wu)是(shi)十七(qi)(qi)酸(而(er)不(bu)是(shi)使(shi)用(yong)化(hua)學和(he)(he)物(wu)理(li)性(xing)(xing)(xing)質與所測定(ding)脂(zhi)(zhi)肪(fang)酸相近(jin)的(de)(de)(de)同位(wei)素(su)標記脂(zhi)(zhi)肪(fang)酸混合物(wu)作內(nei)(nei)(nei)(nei)標)。人類體內(nei)(nei)(nei)(nei)不(bu)能合成(cheng)奇數碳鏈的(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)肪(fang)酸(包括(kuo)碳17酸)，但是(shi)人們(men)可以通過食物(wu)攝(she)取它(ta)們(men)，它(ta)們(men)存在于血液的(de)(de)(de)血漿中(zhong)，增加內(nei)(nei)(nei)(nei)標物(wu)十七(qi)(qi)酸的(de)(de)(de)量(liang)，從而(er)擾亂定(ding)量(liang)分析。

　　進(jin)(jin)(jin)一(yi)步(bu)講，FID不(bu)(bu)能提供分(fen)子(zi)(zi)質量(liang)或其他(ta)結構特征信息，以便區分(fen)不(bu)(bu)同的(de)(de)(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)肪(fang)酸(suan)(suan)(suan)(suan)，所(suo)以色譜(pu)(pu)和FID只是解決(jue)把所(suo)有要研(yan)(yan)究(jiu)的(de)(de)(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)肪(fang)酸(suan)(suan)(suan)(suan)分(fen)子(zi)(zi)完(wan)全分(fen)離(li)開(kai)，用質譜(pu)(pu)解決(jue)脂(zhi)(zhi)肪(fang)酸(suan)(suan)(suan)(suan)的(de)(de)(de)(de)(de)結構信息。大(da)家應(ying)該知道使用電(dian)(dian)子(zi)(zi)轟擊電(dian)(dian)離(li)脂(zhi)(zhi)肪(fang)酸(suan)(suan)(suan)(suan)分(fen)子(zi)(zi)很(hen)容易被打成(cheng)碎(sui)片(pian)，通過這(zhe)些碎(sui)片(pian)可(ke)以進(jin)(jin)(jin)行脂(zhi)(zhi)肪(fang)酸(suan)(suan)(suan)(suan)的(de)(de)(de)(de)(de)結構分(fen)析(xi)(xi)，但是靈敏度受到限制。弱電(dian)(dian)離(li)技術(shu)比如負化(hua)學電(dian)(dian)離(li)(NCI)可(ke)以改善檢測限。使用鹵代衍(yan)(yan)生(sheng)化(hua)試(shi)劑可(ke)以進(jin)(jin)(jin)一(yi)步(bu)提高(gao)檢測靈敏度，這(zhe)種試(shi)劑增加了電(dian)(dian)子(zi)(zi)親和力，可(ke)改善NCI-MS的(de)(de)(de)(de)(de)靈敏度。Kawahara 使用五氟(fu)基芐(PFB) 作衍(yan)(yan)生(sheng)化(hua)試(shi)劑來衍(yan)(yan)生(sheng)化(hua)有機(ji)羧酸(suan)(suan)(suan)(suan)，這(zhe)樣的(de)(de)(de)(de)(de)含氟(fu)衍(yan)(yan)生(sheng)物電(dian)(dian)子(zi)(zi)很(hen)容易被俘獲。此后這(zhe)一(yi)方法擴展到脂(zhi)(zhi)肪(fang)酸(suan)(suan)(suan)(suan)的(de)(de)(de)(de)(de)衍(yan)(yan)生(sheng)化(hua)為(wei)脂(zhi)(zhi)肪(fang)酸(suan)(suan)(suan)(suan)酯，與脂(zhi)(zhi)肪(fang)酸(suan)(suan)(suan)(suan)甲(jia)酯相比，它很(hen)容易被NCI-MS檢測。所(suo)以使用五氟(fu)基芐進(jin)(jin)(jin)行衍(yan)(yan)生(sheng)化(hua)有利于提高(gao)檢測靈敏度。許多研(yan)(yan)究(jiu)者使用PFB做衍(yan)(yan)生(sheng)化(hua)試(shi)劑進(jin)(jin)(jin)行脂(zhi)(zhi)質組學中的(de)(de)(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)肪(fang)酸(suan)(suan)(suan)(suan)分(fen)析(xi)(xi)，例(li)如Quehenberger等就是用這(zhe)一(yi)方法分(fen)析(xi)(xi)巨噬細(xi)胞中的(de)(de)(de)(de)(de)各種脂(zhi)(zhi)肪(fang)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(Prostaglandins, Leukotrienesand Essential Fatty Acids，2008，79：123–129)。下圖4 是分(fen)析(xi)(xi)巨噬細(xi)胞中的(de)(de)(de)(de)(de)各種脂(zhi)(zhi)肪(fang)酸(suan)(suan)(suan)(suan)的(de)(de)(de)(de)(de)色譜(pu)(pu)圖。

圖(tu) 4 巨噬細胞中的各種脂肪酸的色譜圖(tu)

圖中色譜峰的(de)脂肪(fang)酸如下(xia)：

(1)12:0; (2)14:0; (3)15:0; (4)16:1; (5)16:0; (6)17:1; (7)17:0;(8) a18:3; (9) 18:4; (10) g18:3; (11)18:2; (12)18:1; (13)18:0; (14)20:4;(15)20:5; (16)11,14,17–20:3;(17)bishomo-20:3; (18)20:2; (19)5,8,11–20:3; (20)20:0; (21)22:6; (22)22:4; (23)22:5; (24)22:2;(25)22:3; (26)22:1; (27)22:0; (28) 23:0; (29)24:1; (30)24:0;

3 國內外進行氣相色譜分析脂肪酸的一些例證

　　為了進一步(bu)了解進行(xing)氣相色(se)譜分(fen)(fen)(fen)析脂(zhi)肪(fang)(fang)酸的(de)具(ju)體情況，下面表1列出近50例(li)分(fen)(fen)(fen)析各種樣品中(zhong)脂(zhi)肪(fang)(fang)酸的(de)色(se)譜柱和分(fen)(fen)(fen)離對(dui)象。表2列出國外文獻(xian)中(zhong)分(fen)(fen)(fen)析人體組織中(zhong)脂(zhi)肪(fang)(fang)酸的(de)例(li)證。

表(biao) 1 國(guo)內(nei)氣相色(se)譜(pu)分(fen)析脂肪酸的色(se)譜(pu)柱(zhu)和分(fen)析對象

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表 2 國外文獻中(zhong)(zhong)有關分析(xi)人(ren)體組(zu)織中(zhong)(zhong)脂肪酸的衍生化方法和所(suo)用色譜柱

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4 脂肪酸氣相色譜分析所用色譜柱

　　從已發表(biao)的(de)文獻看分析整體脂肪酸(suan)需用(yong)非極性(xing)(xing)的(de)聚(ju)硅(gui)氧(yang)(yang)烷(wan)毛(mao)細管色(se)譜柱，如(ru)聚(ju)二(er)甲基(ji)硅(gui)氧(yang)(yang)烷(wan)，分離(li)多不(bu)飽(bao)和脂肪酸(suan)需用(yong)極性(xing)(xing)強(qiang)的(de)色(se)譜柱，如(ru)OV-275，OV-275(這是聚(ju)硅(gui)氧(yang)(yang)烷(wan)固(gu)定相中極性(xing)(xing)最強(qiang)的(de)色(se)譜柱)和CP-Sil 88(HP-88)。據安捷倫(lun)公司一(yi)(yi)份研究(jiu)報(bao)告(5989-3760 EN)，他們(men)對(dui)最重(zhong)要(yao)(yao)的(de)一(yi)(yi)些(xie)脂肪酸(suan)(甲酯(zhi))(見表(biao)3)進行研究(jiu)，研究(jiu)總結認為：聚(ju)乙二(er)醇(chun)柱對(dui)不(bu)太復雜的(de)樣(yang)品可以得到(dao)(dao)(dao)很好的(de)分離(li);而中等極性(xing)(xing)的(de)氰丙基(ji)聚(ju)硅(gui)氧(yang)(yang)烷(wan)柱(DB 23)對(dui)復雜的(de) FAMEs 樣(yang)品可以得到(dao)(dao)(dao)很好的(de)分離(li)，對(dui)一(yi)(yi)些(xie)順反異(yi)構(gou)體也可以得到(dao)(dao)(dao)分離(li); 要(yao)(yao)使(shi)順反異(yi)構(gou)體分離(li)的(de)更好，就要(yao)(yao)使(shi)用(yong)更高極性(xing)(xing)的(de) HP-88 氰丙基(ji)色(se)譜柱。

表3 重要的(de)一些脂肪酸

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