質譜技術在醫學實驗室檢驗中的多種作用
2018-08-10
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由于質譜(pu)技術(shu)的(de)高特異性、高靈敏度、單(dan)次(ci)分(fen)析(xi)的(de)快速(su)性與檢測信息的(de)豐富性，以及對(dui)復(fu)雜生物基質分(fen)析(xi)的(de)高耐受性等特點，臨床研究和診斷工作也(ye)逐漸倚重于此(ci)類重要(yao)的(de)新型檢測技術(shu)。如：質譜(pu)技術(shu)所能提供的(de)豐富的(de)檢測信息，有助于臨床更加完整地了解疾病和病理狀態，從(cong)而為(wei)患者提供更為(wei)全面和準確的(de)診療服務。
在(zai)美國等發達國家，質譜技術已(yi)廣泛(fan)應用(yong)于醫(yi)學(xue)檢(jian)驗，基于該技術開發出的臨床(chuang)檢(jian)測(ce)項(xiang)目已(yi)有數百項(xiang)，但我(wo)國目前仍處于起步階段，檢(jian)測(ce)項(xiang)目有70余項(xiang);應用(yong)覆蓋面非(fei)常廣泛(fan)，涵蓋了罕見和高難度分析(xi)，包(bao)括(kuo)微生物(wu)鑒(jian)定、生化檢(jian)驗(激(ji)素檢(jian)測(ce)、藥物(wu)濃度監測(ce)、遺傳性(xing)(xing)疾病(bing)檢(jian)測(ce)、營(ying)養(yang)素檢(jian)測(ce)等) 和分子生物(wu)診斷 (蛋白組(zu)學(xue)、核(he)苷酸多態性(xing)(xing)、代(dai)謝組(zu)學(xue)) [1-5];應用(yong)范圍也在(zai)逐步擴展(zhan)，從生化檢(jian)驗、微生物(wu)鑒(jian)定，到代(dai)謝組(zu)學(xue)、脂質組(zu)學(xue)、蛋白組(zu)學(xue)，再到參(can)考(kao)測(ce)量(liang)程序的建立和校準品賦(fu)值，乃(nai)至術中應用(yong)及(ji)床(chuang)旁(pang)檢(jian)測(ce)。
本文將全面闡述質譜技術在醫學實驗室認可中的發展歷程，以及在醫學檢驗領域的主要應用情況和特點，同時剖析了質譜技術目前在臨床應用中主要痛點和未來可能的發展方向，希望能較為全面地綜述質譜技術臨床應用的現狀與未來。
一、質(zhi)譜(pu)技術在醫學實驗室中的發(fa)展
從質(zhi)譜技術(shu)最(zui)(zui)(zui)初進入醫學檢(jian)驗領(ling)域，至今發(fa)(fa)展至多(duo)(duo)領(ling)域、寬范圍(wei)的應用，大(da)約經歷(li)了四十年(nian)的時(shi)間，最(zui)(zui)(zui)早(zao)始于20世紀80年(nian)代(dai)。由于免(mian)疫法檢(jian)測存(cun)在假陽性，質(zhi)譜技術(shu)開始從研究(jiu)性實驗室(shi)走入臨床實驗室(shi)，如氣相色譜質(zhi)譜 (gas chromatography mass spectrometry, GC-MS) 技術(shu)起初應用于軍事(shi)(shi)藥物(wu)監測。推動(dong)這(zhe)種轉變出(chu)現(xian)的是(shi)發(fa)(fa)生在1981年(nian)的美(mei)國(guo)尼(ni)米茲(zi)號(hao)(hao)航(hang)空(kong)母(mu)艦事(shi)(shi)故。尼(ni)米茲(zi)號(hao)(hao)是(shi)美(mei)國(guo)海軍中(zhong)最(zui)(zui)(zui)大(da)的一艘核動(dong)力(li)航(hang)空(kong)母(mu)艦，1981年(nian)5月25日深夜，尼(ni)米茲(zi)號(hao)(hao)在準備回收模擬作戰(zhan)歸來的機群時(shi)發(fa)(fa)生意外，引發(fa)(fa)大(da)火(huo)，該事(shi)(shi)故最(zui)(zui)(zui)終造成(cheng)多(duo)(duo)人死傷(shang)。隨后(hou)采用免(mian)疫法檢(jian)測飛行(xing)員尿液樣本時(shi)發(fa)(fa)現(xian)，大(da)部分尿檢(jian)結(jie)果(guo)中(zhong)大(da)麻代(dai)謝物(wu)呈陽性，表明軍隊(dui)中(zhong)可能存(cun)在藥物(wu)濫用情況。
因免疫法(fa)(fa)檢(jian)測(ce)(ce)結果本(ben)身存在(zai)(zai)較(jiao)高的(de)(de)假陽性率，所以需要(yao)使(shi)用更為特異的(de)(de)GC-MS方法(fa)(fa)進行確認(ren)。而GC-MS在(zai)(zai)應(ying)(ying)用后的(de)(de)10年里使(shi)大麻檢(jian)測(ce)(ce)陽性率從(cong)18%降低至8%，這也促使(shi)了(le)質(zhi)譜(pu)(pu)技術進入毒理實驗(yan)室并(bing)應(ying)(ying)用于濫用藥(yao)物檢(jian)測(ce)(ce)和治療(liao)藥(yao)物監測(ce)(ce)，臨床質(zhi)譜(pu)(pu)檢(jian)測(ce)(ce)開始萌芽。1988年，美國聯邦藥(yao)品檢(jian)驗(yan)局發布強制(zhi)性指南(nan)，要(yao)求治療(liao)藥(yao)物監測(ce)(ce)必須使(shi)用質(zhi)譜(pu)(pu)法(fa)(fa)進行確認(ren)，奠定了(le)質(zhi)譜(pu)(pu)技術在(zai)(zai)治療(liao)藥(yao)物監測(ce)(ce)中的(de)(de)重(zhong)要(yao)地位(wei)[2]。
隨著GC-MS在(zai)(zai)醫學(xue)檢(jian)(jian)驗(yan)領(ling)域應(ying)用(yong)的(de)逐步增多(duo)，免疫法用(yong)于(yu)(yu)類固醇激(ji)素檢(jian)(jian)測(ce)的(de)缺(que)點也日益(yi)凸(tu)顯，尤其是在(zai)(zai)測(ce)定婦(fu)女(nv)和兒(er)童體(ti)內(nei)低濃度睪酮時。但(dan)因GC-MS主(zhu)要適用(yong)于(yu)(yu)揮(hui)發性(xing)和熱穩(wen)定性(xing)化(hua)合物，樣(yang)品(pin)制(zhi)備(bei)程序復(fu)雜，檢(jian)(jian)測(ce)通量低，因此限(xian)制(zhi)了其在(zai)(zai)臨床(chuang)中的(de)應(ying)用(yong)。20世紀(ji)80年代，快原(yuan)子轟(hong)擊、電噴霧(wu)和輔助激(ji)光(guang)解析等“軟電離”技術的(de)發展(zhan)，使蛋白(bai)質(zhi)、酶、核(he)酸等生物大(da)(da)分子的(de)檢(jian)(jian)測(ce)成(cheng)為可能，大(da)(da)大(da)(da)拓展(zhan)了質(zhi)譜(pu)技術在(zai)(zai)醫學(xue)檢(jian)(jian)驗(yan)領(ling)域的(de)應(ying)用(yong)范(fan)圍[1]。
20世(shi)紀90年代，串聯質(zhi)譜技術(shu)開始應(ying)用于新生兒篩查。而電(dian)(dian)噴霧電(dian)(dian)離接口技術(shu) (electrospray ionization interface technology, ESI) 發(fa)(fa)展使(shi)得兩種強有力的(de)分析工具(ju)—液(ye)(ye)相系(xi)(xi)統(tong)和質(zhi)譜系(xi)(xi)統(tong)的(de)結(jie)合成為了(le)可能(neng)，兩者的(de)結(jie)合也(ye)進一步促進了(le)液(ye)(ye)相色(se)譜-串聯質(zhi)譜 (liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS) 技術(shu)在醫學檢(jian)驗、臨床研究及疾病診(zhen)斷(duan)的(de)應(ying)用發(fa)(fa)展。液(ye)(ye)相色(se)譜質(zhi)譜技術(shu)的(de)聯用能(neng)夠使(shi)非揮發(fa)(fa)性和熱不穩定生物分子(zi)電(dian)(dian)離并在極低的(de)濃度下得到(dao)檢(jian)測(ce)，簡化了(le)樣品制備流程，提(ti)高(gao)了(le)檢(jian)測(ce)通量(liang)，極大縮短了(le)報告周(zhou)期，因(yin)而在臨床實驗室的(de)常(chang)規檢(jian)測(ce)工作中得到(dao)了(le)迅猛的(de)發(fa)(fa)展。
21世紀初期，質譜(pu)技術開始嘗試應用(yong)于(yu)感(gan)染(ran)性(xing)疾病(bing)(bing)的(de)(de)(de)檢測(ce)(ce)，如(ru)血源(yuan)性(xing)感(gan)染(ran)疾病(bing)(bing)的(de)(de)(de)分(fen)(fen)子(zi)診(zhen)斷。基質輔助激光(guang)解吸電離(li)技術 (matrix-assisted laser desorption/ionization, MALDI) 的(de)(de)(de)發(fa)展則(ze)完美(mei)地(di)實現了(le)(le)生(sheng)(sheng)(sheng)物大(da)分(fen)(fen)子(zi)的(de)(de)(de)軟離(li)子(zi)化(hua)，通過引入基質分(fen)(fen)子(zi)，使待測(ce)(ce)分(fen)(fen)子(zi)不產生(sheng)(sheng)(sheng)碎片，解決了(le)(le)非揮發(fa)性(xing)和(he)熱不穩(wen)定(ding)性(xing)生(sheng)(sheng)(sheng)物大(da)分(fen)(fen)子(zi)解吸離(li)子(zi)化(hua)的(de)(de)(de)問題，便捷地(di)將生(sheng)(sheng)(sheng)物樣(yang)本引入質譜(pu)系統，并結合飛行時間(jian)(jian)質量分(fen)(fen)析器 (time-of-flight, TOF) 技術，實現了(le)(le)微(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)物的(de)(de)(de)快(kuai)速(su)鑒(jian)定(ding)分(fen)(fen)析，鑒(jian)定(ding)時間(jian)(jian)可(ke)縮短1.45d。相對于(yu)傳統的(de)(de)(de)微(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)物檢測(ce)(ce)方法(fa)，MALDI-TOF可(ke)節省(sheng)人力和(he)時間(jian)(jian)，該應用(yong)也促進(jin)了(le)(le)質譜(pu)技術在大(da)分(fen)(fen)子(zi)檢測(ce)(ce)領(ling)域的(de)(de)(de)廣泛使用(yong)，將質譜(pu)的(de)(de)(de)應用(yong)推上了(le)(le)一個新的(de)(de)(de)臺(tai)階。
2013年，美(mei)國食品(pin)藥品(pin)監督管理局 (Food and Drug Administration, FDA) 首(shou)次認可使用MALDI-TOF對微生物(wu)進行鑒定。另外，近幾年還出現(xian)了(le)將(jiang)質譜技術(shu)(shu)用于(yu)實(shi)時指導癌癥(zheng)外科手術(shu)(shu)的前沿(yan)應用[2,5]。
在我國，質(zhi)譜技術(shu)在醫(yi)學檢(jian)驗中(zhong)的應用最(zui)早也(ye)始于(yu)治療藥物(wu)監測。隨后(hou)，質(zhi)譜技術(shu)在遺(yi)傳代謝病檢(jian)測、營養素檢(jian)測和微生物(wu)鑒(jian)定工作中(zhong)作出的突(tu)出貢(gong)獻，引起行業內的廣泛關注。同(tong)時其(qi)在蛋白組學等研(yan)究領域(yu)也(ye)具有良(liang)好的前景(jing)，有望成為醫(yi)學檢(jian)驗領域(yu)繼基因測序技術(shu)之后(hou)的下一個革命性(xing)技術(shu)。
二、質譜(pu)技術在(zai)醫學檢驗中的主要(yao)應用
1、質譜技術(shu)在臨床生化檢驗中的應(ying)用
質(zhi)譜技術(shu)在(zai)應用較(jiao)早的國家已(yi)成為繼免(mian)疫(yi)學方(fang)法和(he)化學發(fa)光法之(zhi)后(hou)的第(di)三大生(sheng)化檢(jian)(jian)測(ce)技術(shu)。目前采用質(zhi)譜技術(shu)檢(jian)(jian)測(ce)的項目數量(liang)雖然(ran)與(yu)其他兩種方(fang)法相比還有很大差距，但越來越多的生(sheng)化檢(jian)(jian)測(ce)項目正被轉移至質(zhi)譜技術(shu)平臺進行檢(jian)(jian)測(ce);質(zhi)譜技術(shu)也成為生(sheng)化檢(jian)(jian)驗領(ling)域新興的發(fa)展方(fang)向和(he)不(bu)可或缺的重要技術(shu)[6]。
質譜(pu)技(ji)術(shu)在臨床(chuang)生化(hua)檢(jian)(jian)(jian)驗中(zhong)應用(yong)最(zui)為成(cheng)熟的項目主要包括：生化(hua)遺傳檢(jian)(jian)(jian)測(ce)、治(zhi)療藥物(wu)(wu)監測(ce)、類(lei)固(gu)醇激素(su)(su)檢(jian)(jian)(jian)測(ce)、營養素(su)(su)檢(jian)(jian)(jian)測(ce)以及(ji)毒理(li)學檢(jian)(jian)(jian)測(ce)。技(ji)術(shu)高特異性的特點可有效避免結(jie)(jie)構類(lei)似物(wu)(wu)對檢(jian)(jian)(jian)測(ce)結(jie)(jie)果的影響，為臨床(chuang)提(ti)供(gong)更準確的結(jie)(jie)果，提(ti)高患者的依從(cong)性。技(ji)術(shu)高靈敏度的特點可在很大程度上彌補內分(fen)泌(mi)類(lei)固(gu)醇激素(su)(su)檢(jian)(jian)(jian)測(ce)中(zhong)，低(di)濃度化(hua)合(he)物(wu)(wu)檢(jian)(jian)(jian)測(ce)困難(nan)和測(ce)不準的難(nan)題(ti)，為疾病的預測(ce)和診療分(fen)型提(ti)供(gong)準確結(jie)(jie)果。
國(guo)外許多(duo)內分(fen)泌實(shi)驗室已經將大部分(fen)體內激(ji)(ji)素類物(wu)(wu)(wu)質的檢(jian)(jian)(jian)測(ce)由放射免(mian)疫學方法(fa)或免(mian)疫學方法(fa)轉換(huan)為(wei)LC-MS/MS方法(fa)，并(bing)將質譜(pu)技(ji)(ji)術(shu)作為(wei)內分(fen)泌類固醇激(ji)(ji)素類物(wu)(wu)(wu)質檢(jian)(jian)(jian)測(ce)的首選方法(fa)。質譜(pu)技(ji)(ji)術(shu)一(yi)次(ci)可(ke)檢(jian)(jian)(jian)測(ce)多(duo)種化合物(wu)(wu)(wu)的特(te)點，可(ke)提高(gao)檢(jian)(jian)(jian)測(ce)通(tong)(tong)量(liang)、減(jian)(jian)少樣(yang)品(pin)用(yong)量(liang)和降低(di)檢(jian)(jian)(jian)測(ce)成本。如在生化遺傳檢(jian)(jian)(jian)測(ce)中(zhong)，質譜(pu)技(ji)(ji)術(shu)一(yi)次(ci)可(ke)分(fen)析60多(duo)種氨(an)基(ji)酸(suan)和酰基(ji)肉堿(jian)，篩查40余種新(xin)生兒遺傳代謝病;在營養素檢(jian)(jian)(jian)測(ce)中(zhong)一(yi)次(ci)可(ke)分(fen)析20種氨(an)基(ji)酸(suan)、20種脂(zhi)肪酸(suan)、10余種微量(liang)元素或5種脂(zhi)溶性維生素，有效提高(gao)了(le)檢(jian)(jian)(jian)測(ce)通(tong)(tong)量(liang)、減(jian)(jian)少了(le)樣(yang)品(pin)用(yong)量(liang)，并(bing)提供了(le)豐富的檢(jian)(jian)(jian)測(ce)信息;在毒(du)理(li)學檢(jian)(jian)(jian)測(ce)中(zhong)一(yi)次(ci)可(ke)檢(jian)(jian)(jian)測(ce)尿液中(zhong)19種藥物(wu)(wu)(wu)，實(shi)現了(le)高(gao)通(tong)(tong)量(liang)、快速高(gao)效的藥物(wu)(wu)(wu)篩查技(ji)(ji)術(shu)[7]。
在臨(lin)床生化檢驗領域，質(zhi)譜(pu)技(ji)術相比于傳統方法(fa)的優勢較(jiao)為突(tu)出，但隨(sui)著技(ji)術的深(shen)入應(ying)用與經(jing)驗的積累，技(ji)術應(ying)用的缺(que)點(dian)也逐步凸顯出來，包(bao)括質(zhi)譜(pu)技(ji)術應(ying)用的陷(xian)阱問題、實驗室(shi)日常運行過程中的管理問題以及相關政策法(fa)規問題等(deng)，主要體現在：
(1) 質(zhi)譜(pu)(pu)技術在分析(xi)基質(zhi)復雜的(de)生物樣本時，檢測結(jie)果(guo)易受到(dao)基質(zhi)效應、結(jie)構(gou)類(lei)似物干擾以及質(zhi)譜(pu)(pu)信號(hao)產生的(de)不穩定所帶來(lai)的(de)干擾影響;對這(zhe)些(xie)問題認識(shi)和預防不當，則(ze)質(zhi)譜(pu)(pu)的(de)檢測結(jie)果(guo)將存在較大的(de)錯誤風險;
(2) 質譜技術相比于(yu)免(mian)疫學方法(fa)和(he)(he)化學發(fa)光法(fa)，檢測的(de)自(zi)動化程度較低，對(dui)人員依賴(lai)性(xing)較大;同時各廠家儀器系(xi)統還未(wei)實現(xian)與臨床(chuang)實驗(yan)室信息管(guan)理系(xi)統 (LIS) 的(de)接(jie)口(kou)雙向對(dui)接(jie)，在數(shu)據處理和(he)(he)報告發(fa)放環節，仍未(wei)實現(xian)自(zi)動化;
(3) 對于質譜技術(shu)應用較成熟(shu)的(de)項目，檢測數(shu)據(ju)仍缺(que)乏統一的(de)應用標準[4];
(4) 質譜技術檢(jian)測方法所需(xu)的標準物質、試劑(ji)和耗材(cai)等，目前主要依賴于(yu)進口(kou)，較多的檢(jian)測項目受(shou)限于(yu)這些因素而開展受(shou)阻;
(5) 目前質譜實驗室的方法基本為自建方法，標準化和規范化較為薄弱。美國臨床醫學實驗室認可(ke)標準化協會已發布了臨床質譜的使用指南[8]，中華醫學會檢驗醫學分會、衛生計生委臨床檢驗中心和《中華檢驗醫學雜志》編輯部也于2017年10月份共同發布了《液相色譜-質譜臨床應用建議》[9]，這些都為質譜技術臨床檢測工作提供良好了的指導和參考;
(6) 由于質譜技術較(jiao)為(wei)復雜，儀器構成多樣化，在實(shi)際的(de)(de)(de)(de)應用過程中，需要(yao)有經驗的(de)(de)(de)(de)專業技術人(ren)才進行規范的(de)(de)(de)(de)使用操作，但目前國內(nei)相關的(de)(de)(de)(de)技術人(ren)才匱乏;質譜實(shi)驗室的(de)(de)(de)(de)儀器設備(bei)昂貴，對于安裝條件有特(te)殊要(yao)求，建(jian)設需要(yao)投入大量的(de)(de)(de)(de)資(zi)金;這些使得(de)質譜技術臨床應用的(de)(de)(de)(de)門檻較(jiao)高，一定程度上限制了技術的(de)(de)(de)(de)應用;
(7) 在(zai)日常(chang)運營過(guo)程中儀器(qi)的(de)(de)維修(xiu)(xiu)服務成(cheng)本較高，維修(xiu)(xiu)周(zhou)期(qi)較長(chang)，維修(xiu)(xiu)的(de)(de)及時(shi)性也(ye)存在(zai)不(bu)能滿足臨床檢(jian)測的(de)(de)報(bao)告(gao)周(zhou)期(qi)固定性的(de)(de)要求;
(8) 國內對于質譜技(ji)術在臨床的(de)(de)(de)應用監(jian)管(guan)還不成熟，相關(guan)的(de)(de)(de)檢測項(xiang)目(mu)在臨床上(shang)無收費標準，也在一(yi)定程度(du)上(shang)限制了技(ji)術的(de)(de)(de)應用普及(ji)。
雖(sui)然質譜技術(shu)的(de)(de)應(ying)用(yong)仍(reng)存在較多缺陷，但隨(sui)著技術(shu)的(de)(de)革新與(yu)發展，應(ying)用(yong)監管的(de)(de)成(cheng)熟，各項瓶(ping)頸將被不斷突破，未來(lai)隨(sui)著質譜儀器(qi)的(de)(de)各項性能(neng)(neng)的(de)(de)提升(sheng);前處理自(zi)動化(hua)的(de)(de)實現(xian);檢測(ce)數據自(zi)動輸出(chu)并(bing)實現(xian)與(yu)實驗(yan)室信息(xi)系統的(de)(de)雙向(xiang)對接，以及結果報告自(zi)動預(yu)警功能(neng)(neng)的(de)(de)實現(xian)，質譜儀有望像免(mian)疫學(xue)方(fang)法(fa)和(he)化(hua)學(xue)發光法(fa)一(yi)樣，成(cheng)為臨床生(sheng)化(hua)檢驗(yan)中自(zi)動化(hua)、智能(neng)(neng)化(hua)、易用(yong)化(hua)的(de)(de)檢測(ce)平(ping)臺。
2、質譜技術在(zai)微生物檢驗中的應用
近年來，MALDI-TOF技術(shu)(shu)已(yi)成功應用于微(wei)生(sheng)物(wu)(wu)的鑒定(ding)(ding)及分(fen)(fen)(fen)型(xing)，并逐(zhu)漸(jian)成為微(wei)生(sheng)物(wu)(wu)鑒定(ding)(ding)的主流技術(shu)(shu)，可快(kuai)速檢(jian)測和(he)鑒定(ding)(ding)革蘭陽性菌(jun)、革蘭陰性菌(jun)、厭氧菌(jun)、分(fen)(fen)(fen)枝桿菌(jun)、酵母(mu)菌(jun)和(he)絲狀真菌(jun)等[6,10-14]。相比(bi)于傳統的革蘭染色(se)、菌(jun)落形態、表(biao)型(xing)鑒定(ding)(ding)及分(fen)(fen)(fen)子生(sheng)物(wu)(wu)學技術(shu)(shu)， MALDI-TOF技術(shu)(shu)具有快(kuai)速、準確(que)、經濟、高通量(liang)等優(you)點(dian)。MALDI-TOF是(shi)基于細菌(jun)表(biao)面蛋白分(fen)(fen)(fen)子檢(jian)測的技術(shu)(shu)，通過(guo)測定(ding)(ding)未知(zhi)微(wei)生(sheng)物(wu)(wu)自身獨特的蛋白質指紋圖(tu)譜(pu)及特征性的圖(tu)譜(pu)峰，并與數據(ju)庫中參考菌(jun)株(zhu)(zhu)的蛋白指紋圖(tu)譜(pu)進行比(bi)對，從而實現菌(jun)株(zhu)(zhu)的鑒定(ding)(ding)[11]。
該技(ji)術是將(jiang)完(wan)整的(de)(de)微生物細(xi)胞直接(jie)進行(xing)檢測(ce)(ce)，樣品制備簡單(dan)，檢測(ce)(ce)周轉時間短，在數分(fen)(fen)鐘內就可(ke)以得到(dao)一個菌(jun)種(zhong)的(de)(de)測(ce)(ce)試結(jie)果，且分(fen)(fen)析用(yong)菌(jun)量極少，而(er)傳統(tong)方(fang)法完(wan)成(cheng)常規細(xi)菌(jun)鑒定至少需(xu)要8~18h或(huo)更長時間。MALDI-TOF通(tong)(tong)過檢測(ce)(ce)細(xi)菌(jun)胞膜成(cheng)分(fen)(fen)或(huo)表達的(de)(de)特(te)異蛋(dan)白對細(xi)菌(jun)進行(xing)種(zhong)群的(de)(de)鑒別(bie)，敏感(gan)性(xing)和(he)準(zhun)確(que)性(xing)高(gao)，可(ke)以區分(fen)(fen)表型相似或(huo)相同的(de)(de)菌(jun)株，提(ti)供屬(shu)、種(zhong)、型水(shui)平的(de)(de)鑒定，對臨(lin)床常見分(fen)(fen)離菌(jun)鑒定到(dao)種(zhong)水(shui)平的(de)(de)準(zhun)確(que)率很高(gao)。以16S r RNA基(ji)因測(ce)(ce)序結(jie)果為標準(zhun)，質譜(pu)檢測(ce)(ce)結(jie)果準(zhun)確(que)率為90.0%~95.0%[15]，不僅可(ke)以識別(bie)病原(yuan)(yuan)菌(jun)，而(er)且有助于發現新的(de)(de)病原(yuan)(yuan)菌(jun)。此外，質譜(pu)技(ji)術還(huan)用(yong)于病原(yuan)(yuan)體的(de)(de)藥(yao)物敏感(gan)性(xing)檢測(ce)(ce)，常規的(de)(de)藥(yao)物敏感(gan)性(xing)實驗方(fang)法比較費(fei)時，局(ju)限于少數細(xi)菌(jun)，MALDI-TOF通(tong)(tong)過比對耐藥(yao)菌(jun)株和(he)藥(yao)物敏感(gan)菌(jun)株間的(de)(de)特(te)征性(xing)蛋(dan)白和(he)圖譜(pu)峰及檢測(ce)(ce)耐藥(yao)菌(jun)株與抗生素共培(pei)養后(hou)的(de)(de)分(fen)(fen)解產物，可(ke)以分(fen)(fen)析幾乎所有的(de)(de)耐藥(yao)機制。
研究表明，相比(bi)于標準(zhun)的(de)(de)微(wei)生(sheng)物培(pei)養技術，質(zhi)譜技術可降低約50%的(de)(de)試劑成(cheng)(cheng)本和(he)勞(lao)動力成(cheng)(cheng)本[16]。但是(shi)(shi)，MALDI-TOF作為一(yi)項(xiang)新興(xing)技術，在(zai)微(wei)生(sheng)物鑒(jian)(jian)定(ding)方面(mian)也存在(zai)著一(yi)定(ding)的(de)(de)局限性。如對于具有特(te)殊結構的(de)(de)菌種(zhong)(zhong)和(he)圖(tu)譜極為相似的(de)(de)菌種(zhong)(zhong)的(de)(de)鑒(jian)(jian)定(ding)區分(fen)存在(zai)一(yi)定(ding)的(de)(de)難(nan)度、對于一(yi)些(xie)罕見菌種(zhong)(zhong)或新型細菌鑒(jian)(jian)定(ding)困(kun)難(nan)、對血培(pei)養樣本中(zhong)的(de)(de)混合菌種(zhong)(zhong)難(nan)以準(zhun)確鑒(jian)(jian)別等，原因是(shi)(shi)質(zhi)譜數據(ju)庫(ku)中(zhong)標準(zhun)菌株的(de)(de)圖(tu)譜有限、質(zhi)譜峰(feng)的(de)(de)數據(ju)不充分(fen)以及(ji)細菌庫(ku)中(zhong)無這些(xie)菌株[17,18]。
隨(sui)著儀器技(ji)術(shu)參數、質譜數據庫及(ji)分(fen)析(xi)軟件的不斷更新完善，所有的分(fen)離(li)株將(jiang)(jiang)被逐步的明確鑒定出來。因此，隨(sui)著質譜技(ji)術(shu)在臨床微生(sheng)物(wu)實驗(yan)室的應(ying)用(yong)數據庫進一步完善，MALDI-TOF技(ji)術(shu)必將(jiang)(jiang)在微生(sheng)物(wu)鑒定、菌(jun)種分(fen)型、同源分(fen)析(xi)、耐藥監測等多方面發(fa)揮出更大作用(yong)，有望成為新一代病(bing)原微生(sheng)物(wu)診(zhen)斷的常規技(ji)術(shu)。
3、質譜技術在核酸檢測中的應用
核(he)(he)酸質(zhi)譜(pu)檢(jian)測技(ji)術是在MALDI-TOF原(yuan)理的(de)(de)基礎上，結合引(yin)物延伸分(fen)析(xi)(xi)法和堿基特(te)異(yi)裂解分(fen)析(xi)(xi)法，針對雙鏈DNA的(de)(de)特(te)性(xing)(xing)進行了特(te)殊優化，使(shi)樣品在電離(li)過程中不(bu)產生(sheng)或產生(sheng)較少的(de)(de)碎片離(li)子，可(ke)用(yong)于(yu)(yu)檢(jian)測核(he)(he)酸的(de)(de)分(fen)子量(liang)和研究基因(yin)組單(dan)核(he)(he)苷酸多態性(xing)(xing) (single nucleotide polymorphism, SNP) ，是近年來應(ying)用(yong)于(yu)(yu)臨床核(he)(he)酸檢(jian)測的(de)(de)新(xin)型(xing)軟(ruan)電離(li)生(sheng)物質(zhi)譜(pu)[19]。相比于(yu)(yu)以凝膠電泳為基礎的(de)(de)測序法，質(zhi)譜(pu)技(ji)術具有分(fen)辨率(lv)高、分(fen)離(li)速度快(kuai)、雜質(zhi)干擾少的(de)(de)優點，被廣泛應(ying)用(yong)于(yu)(yu)核(he)(he)酸測序、核(he)(he)酸指紋圖譜(pu)、核(he)(he)酸SNP分(fen)析(xi)(xi)等[20]。
SNP是(shi)指基因組DNA序列(lie)上(shang)某個位置單個核苷酸堿(jian)基的差(cha)異，即基因位點的突變，在人群中的發生頻率大于1%，是(shi)決(jue)定個體疾病易(yi)感性(xing)和藥(yao)物反應(ying)性(xing)差(cha)異的重要因素(su)，通過分析突變的位點，可(ke)預測疾病，并提供診斷意見和指導用藥(yao)。MALDI-TOF分析檢測SNP是(shi)根據不同(tong)的分子(zi)量將等(deng)位基因排序，區分和鑒別(bie)相對分子(zi)量達7000左(zuo)右 (含20多(duo)個堿(jian)基) 、僅存在1個堿(jian)基差(cha)別(bie)的不同(tong)DNA，可(ke)以精準(zhun)地分辨到(dao)堿(jian)基種類。
藥物(wu)(wu)代(dai)(dai)謝(xie)(xie)酶(mei)遺傳多(duo)態性(xing)是產(chan)生藥物(wu)(wu)毒副作用(yong)、降低或喪(sang)失藥物(wu)(wu)療效(xiao)的(de)(de)主要(yao)原(yuan)因(yin)之一(yi)，通過檢(jian)(jian)測(ce)藥物(wu)(wu)代(dai)(dai)謝(xie)(xie)酶(mei)的(de)(de)基(ji)因(yin)型(xing)可對(dui)臨床(chuang)用(yong)藥方案進行指導(dao)和調整，為臨床(chuang)個體化用(yong)藥提(ti)供(gong)依(yi)據(ju)。以(yi)往(wang)檢(jian)(jian)測(ce)藥物(wu)(wu)代(dai)(dai)謝(xie)(xie)酶(mei)基(ji)因(yin)多(duo)態性(xing)通常(chang)采用(yong)化學(xue)法(fa)，依(yi)賴于核苷酸的(de)(de)互(hu)補性(xing)對(dui)核酸序列進行分析，對(dui)于序列的(de)(de)長度、復雜性(xing)、反應條件等都具有較高(gao)的(de)(de)要(yao)求，容易受(shou)到(dao)不同程(cheng)度的(de)(de)化學(xue)因(yin)素干擾，導(dao)致檢(jian)(jian)測(ce)結(jie)果出現(xian)偏(pian)差。若(ruo)能將(jiang)化學(xue)和物(wu)(wu)理方法(fa)結(jie)合起來對(dui)藥物(wu)(wu)代(dai)(dai)謝(xie)(xie)酶(mei)基(ji)因(yin)進行檢(jian)(jian)測(ce)，將(jiang)極大提(ti)高(gao)檢(jian)(jian)測(ce)結(jie)果的(de)(de)準(zhun)確性(xing)。
MALDI-TOF是藥物(wu)代(dai)謝酶基(ji)因多(duo)(duo)(duo)態性的(de)(de)(de)新型檢(jian)(jian)測(ce)(ce)方法(fa)，其根(gen)據(ju)核苷酸分子(zi)被(bei)電離后在真空管中的(de)(de)(de)飛行(xing)時間來確定(ding)(ding)其分子(zi)量(liang)大小，最終(zhong)確定(ding)(ding)核苷酸序(xu)列，檢(jian)(jian)測(ce)(ce)結(jie)果僅僅依(yi)賴(lai)于核酸分子(zi)量(liang)。經(jing)過(guo)驗證比較(jiao)，MALDI-TOF檢(jian)(jian)測(ce)(ce)結(jie)果與(yu)Sanger測(ce)(ce)序(xu)的(de)(de)(de)結(jie)果符(fu)合率為100%[21,22]。傳統的(de)(de)(de)Sanger測(ce)(ce)序(xu)方法(fa)雖然是序(xu)列測(ce)(ce)定(ding)(ding)的(de)(de)(de)金標準，但其操作步驟(zou)繁瑣費時和試劑成本(ben)高(gao)等(deng)限(xian)制了其臨床應(ying)用(yong)。MALDI-TOF可通(tong)過(guo)一次實(shi)驗檢(jian)(jian)測(ce)(ce)多(duo)(duo)(duo)個(ge)標本(ben)的(de)(de)(de)多(duo)(duo)(duo)個(ge)突變，實(shi)現(xian)基(ji)因型的(de)(de)(de)高(gao)通(tong)量(liang)、快速(su)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)，為個(ge)體化用(yong)藥提供更加多(duo)(duo)(duo)樣化的(de)(de)(de)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)手段。
4、質譜技術(shu)在蛋白(bai)質組學中的應用
質譜(pu)技術(shu)可檢(jian)測蛋白(bai)質的(de)(de)氨(an)基酸組(zu)(zu)成(cheng)、分子量、多(duo)(duo)肽(tai)或二硫鍵的(de)(de)數目(mu)與位(wei)置(zhi)及(ji)蛋白(bai)質的(de)(de)空間構象等(deng)，從而實現未知肽(tai)段的(de)(de)篩選、測序、肽(tai)指紋圖譜(pu)、蛋白(bai)質表達譜(pu)、蛋白(bai)質翻譯后(hou)修飾譜(pu)、全蛋白(bai)完整無(wu)損分析等(deng)。質譜(pu)多(duo)(duo)樣化的(de)(de)前端連接(jie)方式極(ji)大地(di)促進了研究者對(dui)基礎蛋白(bai)科學領域的(de)(de)認識，但(dan)將這些認識轉(zhuan)變為對(dui)臨床(chuang)實踐的(de)(de)有(you)效信息則有(you)相當大的(de)(de)難度。到目(mu)前為止，基于(yu)質譜(pu)技術(shu)的(de)(de)將蛋白(bai)組(zu)(zu)學多(duo)(duo)樣性的(de)(de)蛋白(bai)和多(duo)(duo)肽(tai)標志物， 成(cheng)功應用于(yu)臨床(chuang)檢(jian)測的(de)(de)案例(li)并不多(duo)(duo)見[22]。
相反，對(dui)于(yu)已(yi)(yi)知的(de)(de)(de)(de)(de)、確定的(de)(de)(de)(de)(de)多(duo)(duo)肽和蛋(dan)(dan)白(bai)標志物即目標蛋(dan)(dan)白(bai)組學(xue)(xue)，質譜技術得(de)到(dao)了較(jiao)好(hao)的(de)(de)(de)(de)(de)應用。目前，已(yi)(yi)經(jing)有(you)(you)一(yi)(yi)(yi)些(xie)關于(yu)LC-MS/MS用于(yu)臨床(chuang)目標多(duo)(duo)肽和蛋(dan)(dan)白(bai)分(fen)(fen)析(xi)的(de)(de)(de)(de)(de)文章發(fa)表，如甲(jia)狀腺球蛋(dan)(dan)白(bai) (Tg) 和淀(dian)粉(fen)樣蛋(dan)(dan)白(bai)的(de)(de)(de)(de)(de)鑒定與定量(liang)分(fen)(fen)析(xi)等[23-25]。質譜技術在(zai)(zai)這一(yi)(yi)(yi)領域的(de)(de)(de)(de)(de)應用，在(zai)(zai)很(hen)多(duo)(duo)情況(kuang)下(xia)均可(ke)為臨床(chuang)提(ti)供(gong)有(you)(you)價值的(de)(de)(de)(de)(de)信(xin)息[21]，如對(dui)某一(yi)(yi)(yi)分(fen)(fen)析(xi)物的(de)(de)(de)(de)(de)免(mian)(mian)疫學(xue)(xue)方(fang)法不存在(zai)(zai)時(shi);已(yi)(yi)經(jing)存在(zai)(zai)的(de)(de)(de)(de)(de)免(mian)(mian)疫學(xue)(xue)方(fang)法不能給(gei)出某些(xie)臨床(chuang)關鍵問題的(de)(de)(de)(de)(de)答案時(shi);已(yi)(yi)經(jing)存在(zai)(zai)的(de)(de)(de)(de)(de)免(mian)(mian)疫學(xue)(xue)方(fang)法存在(zai)(zai)干擾時(shi);某一(yi)(yi)(yi)分(fen)(fen)析(xi)物存在(zai)(zai)多(duo)(duo)個異構體時(shi);對(dui)同一(yi)(yi)(yi)分(fen)(fen)析(xi)物的(de)(de)(de)(de)(de)檢測，不同的(de)(de)(de)(de)(de)檢測方(fang)法間(jian)存在(zai)(zai)較(jiao)大的(de)(de)(de)(de)(de)結果(guo)變異性時(shi);已(yi)(yi)經(jing)存在(zai)(zai)的(de)(de)(de)(de)(de)分(fen)(fen)析(xi)方(fang)法流程(cheng)較(jiao)為復(fu)雜時(shi)，質譜技術均可(ke)發(fa)揮(hui)相應作用，彌補免(mian)(mian)疫學(xue)(xue)方(fang)法的(de)(de)(de)(de)(de)不足。
質(zhi)譜技術在醫學檢(jian)(jian)驗領域中(zhong)應用的(de)下(xia)個目(mu)標和挑戰，是如(ru)何彌補(bu)免(mian)疫學方(fang)法在蛋白和多肽檢(jian)(jian)測方(fang)面的(de)局限性。相信隨著技術的(de)發展(zhan)，這方(fang)面的(de)突破會越(yue)來(lai)越(yue)多，為臨床提供更多的(de)有價值的(de)質(zhi)譜檢(jian)(jian)測數據(ju)。
