一、檢驗(yan)方法驗(yan)證的基本內(nei)容

　　檢(jian)驗方法驗證的(de)基本內容包(bao)括方案的(de)起草及審批，檢(jian)測儀器的(de)確認。

　　適用性(xing)驗(yan)(yan)證(包括(kuo)準(zhun)確(que)度(du)試驗(yan)(yan)、精密度(du)測定、線性(xing)范圍試驗(yan)(yan)、專屬性(xing)試驗(yan)(yan)等)和結(jie)果評價及批準(zhun)四個的(de)方面。

　　二(er)、檢驗方法驗證的(de)基(ji)本步驟(zou)

　　首先(xian)是(shi)制(zhi)定驗(yan)證方(fang)案，然后對大型精密(mi)儀器進行確認(ren)，最關鍵(jian)的一(yi)步是(shi)檢(jian)(jian)驗(yan)方(fang)法(fa)的適用性試驗(yan)，最后是(shi)檢(jian)(jian)驗(yan)方(fang)法(fa)評價及(ji)批準。

　　1、驗證方案的制定

　　檢驗方(fang)法的驗證方(fang)案(an)通常由(you)質(zhi)量(liang)驗證小組提出。根據(ju)產品的工藝條件、原輔料化學結構、中間體、分解產物查(cha)閱有關(guan)資料，提出規(gui)格標準，確(que)定檢查(cha)項目，規(gui)定雜質(zhi)限度，即為質(zhi)量(liang)標準草案(an)。

　　根據質量標(biao)準草案確(que)定檢查和試驗(yan)范圍，對檢驗(yan)方法擬(ni)定具體(ti)操作步(bu)驟，最后經有關人員(yuan)審批(pi)方可實(shi)施。

　　2、大型精密儀器的確認

　　分(fen)析(xi)測試中所用的檢(jian)測儀器一般可分(fen)為三類：

　　A、普通(tong)儀(yi)器：崩解儀(yi)，折光儀(yi)、分析天平、酸度計(ji)、溶(rong)點測定(ding)儀(yi)、電導儀(yi)等(deng);

　　B、較精密(mi)儀器：旋光(guang)(guang)儀、永(yong)停(ting)滴定(ding)儀、費休氏水分(fen)測定(ding)儀、 自動滴定(ding)儀、藥物溶出度儀、可見(jian)分(fen)光(guang)(guang)光(guang)(guang)度計、電泳儀等;

　　C、大型精密儀器(qi)：紫外分光(guang)光(guang)度(du)計、紅(hong)外分光(guang)光(guang)度(du)計、氣相色譜儀、高效液(ye)相色譜儀、薄(bo)層掃描儀等(deng)。

　　為了保證分析測(ce)試數據準確(que)可靠，每臺檢測(ce)儀器在投(tou)入正式使用之前都應進(jin)行確(que)認(ren)。

　　檢測儀器的確認是檢驗方法驗證(zheng)的基礎，應(ying)在其(qi)它驗證(zheng)試驗開始之前首先完(wan)成。

　　檢測儀器確(que)認工作(zuo)內容應(ying)根據儀器類型。技(ji)術性能而定(ding)，通常包括：安裝確(que)認、校正、適用性預試驗和再確(que)認。

　　3、校正

　　校正(zheng)(zheng)是儀器確(que)認及檢(jian)(jian)驗(yan)方法驗(yan)證中的一個重要環(huan)節(jie)，應(ying)當在驗(yan)證試驗(yan)以前(qian)進行校正(zheng)(zheng)。紫外分光(guang)光(guang)度(du)計校正(zheng)(zheng)包括波長校正(zheng)(zheng)、吸收(shou)度(du)測(ce)試、準(zhun)確(que)度(du)測(ce)試、雜散光(guang)檢(jian)(jian)查。

　　氣相色譜(pu)(pu)(pu)儀與(yu)高效液(ye)相色譜(pu)(pu)(pu)儀均要求(qiu)做系統適用性(xing)試(shi)驗(yan)。在規(gui)(gui)定的(de)色譜(pu)(pu)(pu)條件下測定色譜(pu)(pu)(pu)柱的(de)最小理論塔板數(shu)。分(fen)離度和拖尾(wei)因子(zi)，并規(gui)(gui)定變異系數(shu)應不大于(yu)2%。

　　對于化學檢驗中使用(yong)的計量儀器包括容量瓶、移(yi)液管(guan)、滴定管(guan)、分析天(tian)平亦均(jun)應校正。

　　4、適用性預試驗

　　儀器的(de)安裝(zhuang)確認完(wan)成以后，在(zai)其功(gong)能試驗符合要求的(de)情況下，應用(yong)標準品(pin)或對(dui)(dui)照品(pin)對(dui)(dui)其進行適(shi)用(yong)性(xing)檢查，以確認儀器是否符合使用(yong)要求。

　　例如對熔(rong)點測(ce)定儀的適用性(xing)預(yu)試(shi)驗是采用已(yi)知(zhi)溶點的甲(jia)硝唑做試(shi)驗，測(ce)試(shi)結果與已(yi)知(zhi)熔(rong)點比較(jiao)。

　　紫外分光光度計可用已(yi)知含量的(de)某標準品試驗，測得結果與(yu)已(yi)知數(shu)值對比(bi)，確定儀器(qi)是否符合使用要求。

　　在完成上(shang)述各項試驗工作的(de)(de)同時，應(ying)做好相(xiang)應(ying)的(de)(de)文件記錄等資料(liao)歸檔工作，每(mei)一臺儀(yi)器(qi)均(jun)應(ying)有(you)一套(tao)完整的(de)(de)檔案資料(liao)。

　　5、再確認

　　為了確(que)保儀器(qi)處于良(liang)好(hao)的(de)(de)使用狀態，對于一臺新購買(mai)的(de)(de)儀器(qi)在(zai)確(que)認工作結束以后，應(ying)根據儀器(qi)的(de)(de)類(lei)別。確(que)認的(de)(de)經驗(yan)制定再確(que)認的(de)(de)計劃(hua)。

　　再確認的時間間隔和內容要根據儀(yi)器類別(bie)和使用情(qing)況(kuang)決(jue)定，一般(ban)是3個月、6個月或1年。

　　儀器再(zai)確認(ren)的內容(rong)通(tong)常包(bao)括線路連接、附件備品消耗檢查、清潔工(gong)作、功能(neng)(neng)試(shi)(shi)驗、工(gong)作日(ri)記(ji)等，其中重點(dian)安裝確認(ren)中的功能(neng)(neng)試(shi)(shi)驗。

　　三、檢驗方(fang)法的適用性驗證

　　藥品(pin)質量標(biao)準分(fen)析方(fang)法驗證(zheng)的(de)(de)目(mu)的(de)(de)是證(zheng)明采用(yong)的(de)(de)方(fang)法適(shi)合于相應的(de)(de)檢測要求。

　　在(zai)起草藥(yao)品質(zhi)量標(biao)(biao)準(zhun)時，分(fen)析(xi)方(fang)法需經驗證：在(zai)藥(yao)物生產方(fang)法變更、制劑(ji)的組分(fen)變更、原分(fen)析(xi)方(fang)法進行修訂時，則質(zhi)量標(biao)(biao)準(zhun)分(fen)析(xi)方(fang)法也需進行驗證。

　　方法驗證過程(cheng)和結果(guo)均(jun)應記載在藥品標準起草或修訂說明中。

　　根據《中國藥典(dian)》 (2010版(ban))附(fu)錄XIXA的原則(ze)要求(qiu)，檢驗方法的驗證可(ke)分為三(san)種(zhong)情(qing)況處理;

　　1、無需驗證的方法。

　　如藥(yao)(yao)典(dian)(dian)(包(bao)括USP、EP、CP、JP等各國藥(yao)(yao)典(dian)(dian))的方(fang)法(fa)，一(yi)般只(zhi)做系(xi)統(tong)適用性(xing)試驗，以(yi)確認(ren)系(xi)統(tong)是否符合要(yao)求(主(zhu)要(yao)指(zhi)儀器(qi)穩(wen)定性(xing)及(ji)柱的分離(li)度是否達(da)標)。

　　2、對比法。

　　已在參(can)比(bi)實驗(yan)(yan)(yan)(yan)室(shi)驗(yan)(yan)(yan)(yan)證(zheng)過的分析方(fang)法(fa)，可(ke)(ke)用(yong)對比(bi)試驗(yan)(yan)(yan)(yan)的方(fang)法(fa)來(lai)確認方(fang)法(fa)的可(ke)(ke)靠性，即將本實驗(yan)(yan)(yan)(yan)室(shi)與參(can)比(bi)實驗(yan)(yan)(yan)(yan)室(shi)用(yong)同一(yi)方(fang)法(fa)對同批(pi)(pi)樣品所測數據進行(xing)比(bi)較(如至少取五(wu)個批(pi)(pi)號，每(mei)批(pi)(pi)重復測定五(wu)次)，判斷(duan)方(fang)法(fa)在本實驗(yan)(yan)(yan)(yan)室(shi)的可(ke)(ke)行(xing)性。

　　如有差異需查(cha)明原因或設(she)計(ji)方(fang)案，對方(fang)法進(jin)行再驗(yan)證。

　　3、需進行系統驗證的方法。

　　四、檢驗方(fang)法的評(ping)價及批準

　　安裝(zhuang)確(que)認及適(shi)用性試(shi)驗(yan)結束后(hou)，應(ying)將試(shi)驗(yan)數據資(zi)料(liao)進(jin)行匯總(zong)分析(xi)。對檢驗(yan)方(fang)法作出正確(que)的評價(jia)，驗(yan)證報告的說明(ming)及結論部分應(ying)簡明(ming)扼要。

　　試驗(yan)(yan)中的(de)主(zhu)要偏差應(ying)有(you)適當(dang)解釋。然后，報主(zhu)管領(ling)(ling)導(dao)審批。檢驗(yan)(yan)方(fang)法(fa)(fa)驗(yan)(yan)證的(de)最終(zhong)產物(wu)是一個經過驗(yan)(yan)證的(de)方(fang)法(fa)(fa)—根據(ju)驗(yan)(yan)證的(de)結果(guo)制訂的(de)由有(you)關領(ling)(ling)導(dao)批準的(de)檢驗(yan)(yan)方(fang)法(fa)(fa)。

　　五(wu)、如(ru)何(he)詳細計算檢出限?

　　在(zai)(zai)(zai)如(ru)何正確(que)或準確(que)地估(gu)(gu)算檢(jian)(jian)出限的(de)(de)(de)問題上,國際分析界(jie)一(yi)直存(cun)有爭議。檢(jian)(jian)出限的(de)(de)(de)特殊意(yi)義在(zai)(zai)(zai)于(yu)可以(yi)對一(yi)個(ge)(ge)給定的(de)(de)(de)分析方(fang)(fang)法(fa)(fa)在(zai)(zai)(zai)低濃度(du)(du)水(shui)平(ping)的(de)(de)(de)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)能力進行準確(que)地評(ping)估(gu)(gu)，而考察一(yi)個(ge)(ge)分析方(fang)(fang)法(fa)(fa)在(zai)(zai)(zai)低濃度(du)(du)范圍的(de)(de)(de)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)性(xing)能，可以(yi)基于(yu)不同(tong)的(de)(de)(de)角度(du)(du)或不同(tong)的(de)(de)(de)側重(zhong)點,如(ru)可以(yi)從最小信號值與儀器噪音之比來(lai)考察，從方(fang)(fang)法(fa)(fa)測(ce)(ce)定空白的(de)(de)(de)平(ping)均(jun)波動性(xing)來(lai)統計估(gu)(gu)算,也可以(yi)根據分析方(fang)(fang)法(fa)(fa)校準曲(qu)線的(de)(de)(de)偏差特性(xing)來(lai)定量估(gu)(gu)算等(deng)(deng)等(deng)(deng)。

　　檢(jian)出限(xian)是評價(jia)一個分(fen)析方法及測試儀器性(xing)能的重要(yao)指標,所謂(wei)“檢(jian)出”是指定(ding)性(xing)檢(jian)出，即判定(ding)樣品中存在有(you)濃度高(gao)于空白的待測物質(zhi)。

　　ACS(美國化(hua)學學會(hui))對這一定(ding)義作了更簡明的概括:檢(jian)出(chu)限是一個分(fen)析方(fang)法能(neng)夠可靠(kao)地(di)檢(jian)測出(chu)被分(fen)析物(wu)的最低濃度。

　　1、檢測限(limit of detection, LOD)定義:

　　在樣(yang)品中能(neng)檢(jian)(jian)出的(de)被測(ce)(ce)組分的(de)最低濃度(du)(量)稱為(wei)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)限，即產生(sheng)信號(hao)(峰(feng)高)為(wei)基(ji)線噪音(yin)標準(zhun)差(cha)k倍(bei)時(shi)的(de)樣(yang)品濃度(du)，一般為(wei)信噪比(bi)(S/N)2:1或3:1時(shi)的(de)濃度(du)，對其測(ce)(ce)定(ding)的(de)準(zhun)確度(du)和精(jing)密度(du)沒有確定(ding)的(de)要求。目前(qian)，一般將檢(jian)(jian)測(ce)(ce)限定(ding)義為(wei)信噪比(bi)(S/N)3:1時(shi)的(de)濃度(du)。

　　2、計算公式為：

　　D=3N/S (1)

　　式中：N——噪音; S——檢(jian)測(ce)器靈敏度;D——檢(jian)測(ce)限

　　而(er)靈敏度的(de)計(ji)算公(gong)式(shi)為：

　　S=I/Q (2)

　　式中：S——靈敏度;I——信(xin)號響應(ying)值;Q——進樣(yang)量

　　將式(1)和式(2)合并，得(de)到下式：

　　D=3N×Q/I (3)

　　式(shi)中：Q——進(jin)樣(yang)量;N——噪音;I——信(xin)號響應值。I/N即為(wei)該進(jin)樣(yang)量下(xia)的信(xin)噪比(S/N)，該信(xin)噪比可通過工作站(zhan)對圖譜(pu)(pu)進(jin)行(xing)自動分析(xi)獲得，一般的色譜(pu)(pu)或(huo)質譜(pu)(pu)工作站(zhan)都(dou)可進(jin)行(xing)信(xin)噪比分析(xi)計算。這(zhe)樣(yang)檢(jian)測限的計算方(fang)法(fa)就變得非常方(fang)便了。

　　3、計算方法：

　　實際計算(suan)時，檢出限有2種(zhong)表示方法：一種(zhong)是(shi)進樣(yang)瓶中樣(yang)品(pin)檢測限，一種(zhong)是(shi)針對原(yuan)始樣(yang)品(pin)的方法檢出限。

　　A、對第一種檢(jian)測限，只要(yao)知道進(jin)樣(yang)量和信(xin)噪比即可(ke)計(ji)算。如進(jin)樣(yang)瓶中樣(yang)品濃度(du)為(wei)1 mg/L,在此濃度(du)下的信(xin)噪比為(wei)300(由工作(zuo)站分析獲得)，則(ze)其檢(jian)測限為(wei)：D =(3×1 mg L-1)/300 = 0.01 mg/L。也可(ke)用絕對進(jin)樣(yang)量表示，若(ruo)進(jin)樣(yang)體積為(wei)10 ul，則(ze)其檢(jian)測限為(wei)：D = 3×(1 mgL-1×10 ul)/300 = 0.1 ng。

　　B、對第二種表示方法，需同時(shi)考(kao)慮原始(shi)樣品的取(qu)樣量(liang)和(he)提取(qu)樣品的定容(rong)體積(ji)。仍按前(qian)述樣品計算，若取(qu)樣量(liang)為5克，最后定容(rong)體積(ji)為5 mL，則(ze)方法檢測限(xian)為：D = 0.01 mgL-1×5 mL/5 g = 0.01 mg/kg。

　　即當(dang)原始(shi)樣(yang)品中待檢(jian)物(wu)質的濃(nong)度為(wei)0.01mg/kg時(shi)(shi)，若取樣(yang)量為(wei)5g,樣(yang)品經前處理后(hou)定容體積為(wei)5mL時(shi)(shi),進樣(yang)瓶(ping)中樣(yang)品的濃(nong)度可達0.01mg/L(假定回收率為(wei)100%),此時(shi)(shi)，在其它給(gei)定的分析條(tiao)件下，能產生3倍噪聲強度的信(xin)號。在實際檢(jian)測(ce)工作中，第二種表示方法更為(wei)常見。

　　4、注意事項

　　由式(3)可見，信(xin)噪比的(de)(de)大(da)小直接關(guan)系到檢測限(xian)的(de)(de)大(da)小。信(xin)噪比計(ji)算(suan)方法的(de)(de)不同，其比值(zhi)大(da)小有(you)(you)很(hen)大(da)不同，這與計(ji)算(suan)信(xin)噪比時(shi)基線噪聲峰值(zhi)的(de)(de)定義方式有(you)(you)關(guan)，一般(ban)有(you)(you)三種不同的(de)(de)定義：

　　A、峰/峰(peak to peak)信噪比，用某一(yi)段基線噪聲的(de)平均高度;

　　B、峰/半峰(half peak to peak)信(xin)噪比(bi), 用某一(yi)段基線(xian)噪聲(sheng)平(ping)均(jun)高度(du)的1/2;

　　C、均方根(RMS)信噪(zao)比，用某一段(duan)基線噪(zao)聲的均方根值計算(suan)。

　　除此之外(wai)，信(xin)噪比的計(ji)算(suan)結果還和所取(qu)噪聲(sheng)的位置有很大(da)關系(xi)，取(qu)信(xin)號哪一(yi)側(ce)基線(xian)(xian)的噪聲(sheng)，取(qu)多(duo)長(chang)一(yi)段(duan)基線(xian)(xian)上(shang)的噪聲(sheng)，計(ji)算(suan)結果都很不完全相同(tong)，有時相差甚(shen)遠。一(yi)般多(duo)取(qu)樣品峰兩側(ce)的噪聲(sheng)峰值計(ji)算(suan)。

　　5、檢出限的確定

　　A、《全球環(huan)境(jing)監測(ce)(ce)系(xi)統水監測(ce)(ce)操作(zuo)指南(nan)》中(zhong)規定(ding)(ding)：給定(ding)(ding)置信水平為95%時，樣(yang)品(pin)測(ce)(ce)定(ding)(ding)值與(yu)零濃度樣(yang)品(pin)的測(ce)(ce)定(ding)(ding)值有顯著(zhu)性差異(yi)即為檢出(chu)限：

　　L = 4.6Sb

　　式中(zhong)：L——方法的(de)最低(di)檢出濃度。

　　Sb ——測定(ding)次(ci)數為n次(ci)的空白(bai)平(ping)行測定(ding)(批內(nei))標準(zhun)差(重復測定(ding)20次(ci)以上)。

　　B、國際(ji)純粹和應用化學聯(lian)合會(IUPAC)規定對各種光(guang)學分(fen)析方法，可(ke)用下式計(ji)算：

　　L = KSb/S

　　L——方(fang)法的最低檢出濃度(du)

　　Sb——空白多(duo)次測量的標(biao)準偏差(cha)(吸(xi)光度(du));

　　S ——方法的(de)靈(ling)敏(min)度(du)(即校準曲線的(de)斜率(lv))

　　為了評估 ，空(kong)白測(ce)定次數(shu)必須足(zu)夠多，最好能測(ce)20次。國際純粹和應用化學(xue)聯合會極力提倡取(qu)k值為3，一(yi)般來說，取(qu) 相應的(de)置信水平(ping)大約為90%。

　　若 =0，并(bing)不意味(wei)著 ，或檢出限無限小(xiao)。這時需配制(zhi)一個(ge)濃(nong)度略(lve)大(da)于零濃(nong)度的試(shi)樣系列(能產生(sheng)一個(ge)可測(ce)信號值)代替全程序空白試(shi)驗，求出其(qi)標準偏(pian)差(cha)，用來代替 。

　　此外，有時為了(le)工作(zuo)方便(bian)和便(bian)于(yu)比較，也規定(ding)一個大(da)家能接(jie)受的(de)信號(hao)值作(zuo)為檢出限(xian)，如(ru)分(fen)光(guang)光(guang)度(du)法中(zhong)，規定(ding)吸光(guang)度(du)為0.010所對應的(de)濃度(du)即為檢出限(xian)L。

　　C、 美國EPA SW—846規(gui)定方法中的檢出(chu)限為：

　　L=3.143Sb

　　D、某些分光(guang)光(guang)度(du)法是以吸光(guang)度(du)(扣除空白)為0.010相對(dui)應的(de)濃度(du)值或絕對(dui)量為檢出限，這是一(yi)種(zhong)實驗室間的(de)協(xie)定方案。

　　E、氣相(xiang)(xiang)色譜法(fa)：檢測器恰能產生與噪音相(xiang)(xiang)區(qu)別(bie)的(de)響應信(xin)號(hao)時所需進入色譜的(de)物質最小(xiao)量為(wei)檢出限，一般為(wei)噪音的(de)二倍。

　　F、離(li)子選(xuan)擇電極(ji)法：當校準曲線的直(zhi)(zhi)線部分外延的延長線與通過空白電位且平(ping)行于濃度軸的直(zhi)(zhi)線相交時，其交點所對應的濃度值即為該離(li)子色譜所對電極(ji)法的檢出限。

　　由(you)測得(de)的空白(bai)值(zhi)計算(suan)出的L值(zhi)不應大(da)于分析方(fang)法(fa)規定的最低檢出濃度(du)值(zhi)，如(ru)大(da)于方(fang)法(fa)規定值(zhi)時，必須尋找原(yuan)因降低空白(bai)值(zhi)，重新測定計算(suan)至(zhi)合(he)格。

　　6、校正曲線繪制：

　　A、按分析方法步驟，通過實(shi)測(ce)濃度(du)和儀(yi)器信號(hao)值(zhi)的(de)直線關系，確定實(shi)驗室條件(jian)下(xia)的(de)測(ce)定上限。當測(ce)定上限低于方法的(de)檢測(ce)上限時(shi)，只(zhi)能用(yong)實(shi)測(ce)的(de)直線范圍。

　　B、繪制校(xiao)正曲(qu)線的分析步驟應與樣(yang)品(pin)分析相同，并(bing)且不少于(yu)5個濃度值。

　　C、校(xiao)正曲(qu)線(xian)繪制與每批(pi)測(ce)定樣(yang)品(pin)同時進行，對某些(xie)分析方(fang)法的校(xiao)正曲(qu)線(xian)的斜率穩(wen)定，批(pi)間(jian)誤(wu)差較小，使用原制校(xiao)正曲(qu)線(xian)時，應與樣(yang)品(pin)同時測(ce)定2份中等濃度標樣(yang)和2份空白的平行樣(yang)。

　　測得標準的濃(nong)度(減去空(kong)白)值與(yu)原校(xiao)正曲線(xian)相(xiang)對應的濃(nong)度值的相(xiang)對偏差(cha)，分(fen)光光度應小于5%;原子吸(xi)收法應小于10%，否則重新制作校(xiao)正曲線(xian)。

　　六、小結

　　最后還要特別(bie)強調，檢(jian)出限(xian)(xian)(xian)和測(ce)定(ding)下限(xian)(xian)(xian)是(shi)兩(liang)個(ge)不同的(de)概(gai)念(nian)，它(ta)們是(shi)評(ping)價(jia)一個(ge)分析方法及測(ce)試儀器性能(neng)的(de)重要指標(biao)，檢(jian)出限(xian)(xian)(xian)是(shi)一個(ge)定(ding)性概(gai)念(nian)，而測(ce)定(ding)下限(xian)(xian)(xian)是(shi)一個(ge)定(ding)量概(gai)念(nian)，搞清楚兩(liang)者(zhe)概(gai)念(nian)和相互(hu)關系，可提高(gao)色(se)譜(pu)分析中(zhong)檢(jian)測(ce)結果(guo)的(de)準(zhun)確(que)性和可靠性，特別(bie)在(zai)痕量分析中(zhong)，檢(jian)出限(xian)(xian)(xian)和測(ce)定(ding)下限(xian)(xian)(xian)的(de)確(que)定(ding)對于分析方法的(de)選擇具(ju)有重要意(yi)義，同樣的(de)，對于實驗(yan)室質量控制(zhi)也具(ju)有很重要的(de)意(yi)義。