2015年6月(yue)17日，“第四屆中(zhong)國(guo)食(shi)品與農產(chan)品質量安全(quan)(quan)檢測(ce)(ce)技(ji)術(shu)國(guo)際論壇暨展(zhan)覽(lan)會(hui)”在北京國(guo)家(jia)會(hui)議中(zhong)心開幕。此次會(hui)議特別(bie)設置了“食(shi)品與農產(chan)品安全(quan)(quan)微生(sheng)物檢測(ce)(ce)”、“食(shi)品與農產(chan)品中(zhong)重金屬元素和(he)其他有害物質檢測(ce)(ce)”、“飲用水(shui)安全(quan)(quan)檢測(ce)(ce)”等(deng)九個專題。大會(hui)第二天，來自北京出(chu)入境檢驗檢疫(yi)局的(de)(de)曾靜博士在“食(shi)品與農產(chan)品安全(quan)(quan)微生(sheng)物檢測(ce)(ce)”專題中(zhong)做了題為“微生(sheng)物鑒(jian)定技(ji)術(shu)的(de)(de)發(fa)展(zhan)歷程”的(de)(de)報告。

專題現場

北京出入境檢驗檢疫局 曾靜博士

　　隨著人(ren)們生活水平的(de)(de)不斷(duan)提高，食品(pin)安全問題(ti)越(yue)來越(yue)受到(dao)人(ren)們的(de)(de)重視，微生物(wu)(wu)對(dui)食品(pin)的(de)(de)污染問題(ti)也相應地備受關注。微生物(wu)(wu)包括細菌(jun)、真菌(jun)等，有些微生物(wu)(wu)還(huan)是致(zhi)病菌(jun)，對(dui)人(ren)體(ti)的(de)(de)危害(hai)很(hen)大，因此食品(pin)中微生物(wu)(wu)的(de)(de)檢測(ce)非常重要。

　　在報告中曾靜介(jie)紹，微生(sheng)物(wu)(wu)鑒(jian)定技術(shu)在檢(jian)驗檢(jian)疫;食品、化妝(zhuang)品等產(chan)品致病(bing)菌(jun)(jun)(jun)的(de)檢(jian)測;動物(wu)(wu)源性致病(bing)菌(jun)(jun)(jun)的(de)檢(jian)測;植物(wu)(wu)病(bing)原細菌(jun)(jun)(jun)、真菌(jun)(jun)(jun)的(de)檢(jian)測等工作中起到非常關鍵的(de)作用(yong)。檢(jian)驗檢(jian)疫工作中的(de)微生(sheng)物(wu)(wu)鑒(jian)定工作主要有(you)判斷該菌(jun)(jun)(jun)是不是目標的(de)致病(bing)菌(jun)(jun)(jun)和(he)新發現的(de)菌(jun)(jun)(jun)的(de)種(zhong)類(lei)兩項內容。相比(bi)而(er)言，后(hou)者需要做更完善的(de)實驗，參考多種(zhong)方法相互印(yin)證(zheng)以后(hou)才能確定該菌(jun)(jun)(jun)的(de)種(zhong)類(lei)。

　　曾靜說，目前微(wei)(wei)生(sheng)物(wu)鑒(jian)定技術的發(fa)展(zhan)有(you)兩個方(fang)向(xiang)，速度快和分型(xing)能力(li)強。速度快的微(wei)(wei)生(sheng)物(wu)鑒(jian)定技術主要以飛行(xing)時間質譜(pu)(MALDI-TOF MS)鑒(jian)定技術為典(dian)型(xing)代表(biao)，可以在數十秒內(nei)實現微(wei)(wei)生(sheng)物(wu)的鑒(jian)定;分型(xing)能力(li)強的鑒(jian)定技術主要包括各(ge)種基于DNA的鑒(jian)定技術。

　　在報(bao)告(gao)中，曾靜介紹，微(wei)生(sheng)物(wu)(wu)鑒(jian)(jian)定(ding)技術(shu)主要(yao)有形(xing)態(tai)學觀察、全自(zi)動微(wei)生(sheng)物(wu)(wu)生(sheng)化鑒(jian)(jian)定(ding)系統和依據細胞物(wu)(wu)質進(jin)行(xing)微(wei)生(sheng)物(wu)(wu)鑒(jian)(jian)定(ding)技術(shu)等方(fang)法(fa)。她在報(bao)告(gao)中對(dui)三(san)種方(fang)法(fa)進(jin)行(xing)了(le)詳細的闡(chan)述。

　　據(ju)她介(jie)紹，微(wei)(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)的(de)形態(tai)(tai)學觀(guan)察主(zhu)要(yao)是依(yi)據(ju)微(wei)(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)的(de)形態(tai)(tai)和生(sheng)(sheng)(sheng)理生(sheng)(sheng)(sheng)化反(fan)應等特征來進(jin)行(xing)微(wei)(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)的(de)分類和鑒(jian)定(ding)(ding)。用(yong)微(wei)(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)的(de)形態(tai)(tai)特征來鑒(jian)定(ding)(ding)微(wei)(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)是由于微(wei)(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)的(de)形態(tai)(tai)比較單一，容易分辨;用(yong)微(wei)(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)的(de)生(sheng)(sheng)(sheng)理生(sheng)(sheng)(sheng)化反(fan)應特征來鑒(jian)定(ding)(ding)微(wei)(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)主(zhu)要(yao)是依(yi)據(ju)微(wei)(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)細(xi)胞壁的(de)組成、微(wei)(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)發酵產物(wu)(wu)和微(wei)(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)對碳源、氮源等養分的(de)利(li)用(yong)。

　　曾(ceng)靜同時提到這(zhe)種方法相對比較繁瑣、耗時，因此近年來被全(quan)自動(dong)微生物生化鑒定系統逐(zhu)步替(ti)代。

　　她介紹道，全自動(dong)微生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)生(sheng)(sheng)化(hua)鑒(jian)定(ding)(ding)系統實(shi)(shi)際上(shang)是(shi)將多(duo)個生(sheng)(sheng)化(hua)反(fan)(fan)應有效整合(he)(he)、濃(nong)縮(suo)于商業化(hua)的(de)(de)(de)板(ban)卡(ka)上(shang)，方便實(shi)(shi)驗室(shi)進行微生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)的(de)(de)(de)鑒(jian)定(ding)(ding)。全自動(dong)微生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)生(sheng)(sheng)化(hua)鑒(jian)定(ding)(ding)系統具有以(yi)下(xia)優點：1.生(sheng)(sheng)化(hua)反(fan)(fan)應數(shu)量多(duo)，商業化(hua)的(de)(de)(de)卡(ka)板(ban)最多(duo)可集合(he)(he)45-46種生(sheng)(sheng)化(hua)反(fan)(fan)應;2.實(shi)(shi)驗操作標準化(hua)，節省(sheng)大量人(ren)工(gong);3.鑒(jian)定(ding)(ding)速度(du)快(kuai)，一般3-4小(xiao)時即可出(chu)鑒(jian)定(ding)(ding)結(jie)果(guo)。基于以(yi)上(shang)優點，目前，全自動(dong)微生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)生(sheng)(sheng)化(hua)鑒(jian)定(ding)(ding)系統已經作為實(shi)(shi)驗室(shi)中微生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)的(de)(de)(de)日(ri)常(chang)鑒(jian)定(ding)(ding)手段。除此之(zhi)外，全自動(dong)微生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)生(sheng)(sheng)化(hua)鑒(jian)定(ding)(ding)系統還(huan)具有細(xi)菌的(de)(de)(de)MIC值測(ce)定(ding)(ding)和耐藥表型的(de)(de)(de)檢測(ce)等作用。

　　曾靜在介紹(shao)依據細胞(bao)物(wu)質(zhi)進行微生(sheng)物(wu)鑒(jian)(jian)(jian)定(ding)技(ji)術(shu)(shu)時說，該技(ji)術(shu)(shu)主(zhu)(zhu)要(yao)(yao)包括蛋白(bai)質(zhi)的(de)檢測和DNA的(de)檢測，是目前微生(sheng)物(wu)鑒(jian)(jian)(jian)定(ding)技(ji)術(shu)(shu)的(de)兩(liang)個發展方(fang)向。依據蛋白(bai)質(zhi)檢測的(de)鑒(jian)(jian)(jian)定(ding)技(ji)術(shu)(shu)，具有鑒(jian)(jian)(jian)定(ding)速度(du)快的(de)特(te)點，主(zhu)(zhu)要(yao)(yao)檢測儀(yi)器有飛行時間(jian)質(zhi)譜(pu)。基(ji)于DNA檢測的(de)鑒(jian)(jian)(jian)定(ding)技(ji)術(shu)(shu)，對微生(sheng)物(wu)的(de)分型能力很強，該檢測技(ji)術(shu)(shu)主(zhu)(zhu)要(yao)(yao)有16S rDNA測序(xu)技(ji)術(shu)(shu)、PFGE和全基(ji)因組測序(xu)技(ji)術(shu)(shu)等(deng)。

　　在蛋白質檢(jian)測方面，曾靜介(jie)紹說，利用飛行(xing)(xing)時間質譜進行(xing)(xing)微生物(wu)鑒定(ding)的(de)原(yuan)理是通過質譜獲得微生物(wu)特征蛋白質分子的(de)“指紋圖譜”，然后與大容(rong)量的(de)數據庫進行(xing)(xing)對比，最終實現菌(jun)落或(huo)者菌(jun)株水平上的(de)鑒定(ding)。質譜鑒定(ding)系統(tong)的(de)優勢主要體現在鑒定(ding)速(su)度(du)快，僅(jin)需(xu)十余秒即可完(wan)成。

　　在(zai)DNA檢測(ce)技術(shu)方面，曾靜分別(bie)就16S rDNA測(ce)序技術(shu)、PFGE和全基因(yin)組(zu)測(ce)序技術(shu)做了詳(xiang)細的闡述。

　　她說道，16S rDNA基(ji)因(yin)(yin)是細(xi)(xi)菌(jun)(jun)(jun)核糖體DNA的(de)(de)(de)一部分，被稱為細(xi)(xi)菌(jun)(jun)(jun)的(de)(de)(de)“活(huo)化(hua)石”，該(gai)基(ji)因(yin)(yin)進化(hua)速度(du)十分緩慢，具有(you)生物鐘的(de)(de)(de)特點，已經(jing)作為細(xi)(xi)菌(jun)(jun)(jun)系統(tong)發育的(de)(de)(de)目的(de)(de)(de)基(ji)因(yin)(yin)，16S rDNA序(xu)(xu)列(lie)測(ce)定(ding)(ding)是科研領域細(xi)(xi)菌(jun)(jun)(jun)分類和(he)鑒定(ding)(ding)的(de)(de)(de)金標準。目前，常見的(de)(de)(de)商業化(hua)測(ce)序(xu)(xu)系統(tong)有(you)針(zhen)對細(xi)(xi)菌(jun)(jun)(jun)16S rDNA中的(de)(de)(de)500bp保守序(xu)(xu)列(lie)進行測(ce)序(xu)(xu)、針(zhen)對真(zhen)菌(jun)(jun)(jun)的(de)(de)(de)28S rDNA的(de)(de)(de)D2基(ji)因(yin)(yin)區域進行測(ce)序(xu)(xu)等。該(gai)方法獲得(de)的(de)(de)(de)數(shu)據(ju)有(you)利于(yu)致病菌(jun)(jun)(jun)的(de)(de)(de)溯源(yuan)分析，但是操作過程具有(you)一定(ding)(ding)的(de)(de)(de)復雜度(du)，耗時(shi)較長，另外，基(ji)因(yin)(yin)測(ce)序(xu)(xu)儀(yi)和(he)測(ce)序(xu)(xu)耗材(cai)試劑的(de)(de)(de)價(jia)格較貴，因(yin)(yin)此(ci)不利于(yu)在(zai)應(ying)用層面(mian)進行推廣。

　　報告(gao)中(zhong)，曾靜對(dui)PFGE闡述道，PFGE(脈(mo)沖場凝膠電泳)是一種(zhong)分離(li)(li)大分子DNA的(de)(de)方法(fa)(fa)。此(ci)種(zhong)方法(fa)(fa)的(de)(de)原理是將細(xi)菌(jun)包埋于瓊脂塊(kuai)中(zhong)，用(yong)(yong)適當(dang)的(de)(de)內(nei)切(qie)酶(mei)(mei)在原位對(dui)整個(ge)細(xi)胞染(ran)色體進行(xing)酶(mei)(mei)切(qie)，酶(mei)(mei)切(qie)片段(duan)在特定的(de)(de)電泳系統中(zhong)通過電場方向的(de)(de)不斷交替變(bian)換(huan)和適合的(de)(de)脈(mo)沖時(shi)間等(deng)條件作用(yong)(yong)而得到良好分離(li)(li)的(de)(de)方法(fa)(fa)。PFGE的(de)(de)分型(xing)能(neng)力(li)極(ji)強，可區分菌(jun)株水平(ping)的(de)(de)差異，目前被(bei)全世界各個(ge)國家(jia)普(pu)遍(bian)使用(yong)(yong)。通過PFGE分型(xing)可以(yi)對(dui)細(xi)菌(jun)性(xing)傳染(ran)病(bing)、食源性(xing)致病(bing)菌(jun)進行(xing)監測，同時(shi)可以(yi)進行(xing)分子流(liu)行(xing)病(bing)學(xue)的(de)(de)調查(cha)，但是操作較(jiao)為繁(fan)瑣，需(xu)要(yao)較(jiao)高的(de)(de)實驗技能(neng)方可掌(zhang)握。

　　在(zai)全基因(yin)(yin)組測序技術(shu)(shu)方面，曾(ceng)靜(jing)介紹說，該技術(shu)(shu)可(ke)以對菌(jun)株進行(xing)最(zui)為有效的分(fen)型(xing)(xing)，即(ji)使是(shi)(shi)16S差異不大(da)的菌(jun)株，也(ye)可(ke)以通過分(fen)布在(zai)整(zheng)個基因(yin)(yin)組上的單(dan)核(he)苷酸(suan)多態性位點(SNP)進行(xing)區分(fen)，是(shi)(shi)目(mu)前分(fen)型(xing)(xing)能力(li)最(zui)為強大(da)的技術(shu)(shu)之一。全基因(yin)(yin)組測序用于微生(sheng)物鑒定(ding)工(gong)作的主要障礙在(zai)于使用成本高和(he)專業的數據(ju)分(fen)析。

　　最后，曾靜提到，對于檢(jian)驗檢(jian)疫工(gong)作來說，需要(yao)根據(ju)實際情況選擇合適的(de)微生(sheng)物(wu)鑒定(ding)方法。同時，為了(le)更快(kuai)速、更準確的(de)確認病原微生(sheng)物(wu)，可能(neng)需要(yao)幾種鑒定(ding)方法聯合使用，例如可以先利(li)用質譜(pu)鑒定(ding)速度(du)快(kuai)的(de)優勢迅速判斷致(zhi)病菌，然后再(zai)利(li)用分(fen)(fen)子(zi)生(sheng)物(wu)學的(de)手段進(jin)行(xing)分(fen)(fen)型和流(liu)行(xing)病學的(de)調(diao)查。