PCR實驗室的污染來源

　　1、樣(yang)本間交叉(cha)污染：

　　收集樣(yang)本(ben)(ben)(ben)(ben)的容器(qi)(qi)被(bei)污染或樣(yang)本(ben)(ben)(ben)(ben)密封不嚴外溢;不同(tong)樣(yang)本(ben)(ben)(ben)(ben)移液(ye)時(shi)忘(wang)記更(geng)換(huan)槍尖或未使用帶濾(lv)芯槍尖;移液(ye)器(qi)(qi)等實驗器(qi)(qi)具及(ji)耗材未及(ji)時(shi)消毒滅(mie)菌;不同(tong)樣(yang)本(ben)(ben)(ben)(ben)同(tong)時(shi)開蓋(gai)或樣(yang)本(ben)(ben)(ben)(ben)劇(ju)烈震蕩、反復吹吸導致氣溶膠形成擴散，相互交叉(cha)污染。

　　2、實驗試劑污染(ran)：

　　主要是在(zai) PCR 組分(fen)試劑(ji)加(jia)樣過(guo)程中，由于移液器、容器、陰性(xing)對(dui)照及其它試劑(ji)被核酸模板或陽性(xing)對(dui)照污染。 加(jia)樣過(guo)程中，因為 PCR 試劑(ji)對(dui)溫度十(shi)分(fen)敏感，需(xu)要通過(guo)冰浴(yu)使得 PCR 試劑(ji)和 PCR 板/管處(chu)于 0℃，但這個過(guo)程也是充滿(man)了(le)污染的風險(xian)的。

　　3、擴增產物(wu)污染：

　　大(da)量(liang)拷(kao)貝(bei)的(de)(de)(de)產物泄漏(lou)或擴增后(hou)的(de)(de)(de)PCR反應管(guan)意(yi)外開(kai)蓋，這(zhe)是 PCR 反應中最主要最常(chang)見的(de)(de)(de)污染問題。因為 PCR 產物拷(kao)貝(bei)量(liang)大(da)，遠遠高于 PCR 檢測數個(ge)拷(kao)貝(bei)的(de)(de)(de)極(ji)限(xian)，所以極(ji)微(wei)量(liang)的(de)(de)(de) PCR 產物污染，就可形成假陽性。

　　4、克(ke)隆(long)質粒污染：

　　作為陽性質(zhi)(zhi)控品的克隆質(zhi)(zhi)粒(li)外溢。

　　PCR實驗室的防污染方法

　　按照實驗室的安(an)全工作(zuo)制(zhi)度或安(an)全標準操作(zuo)程(cheng)序，所有操作(zuo)符(fu)合《實驗室生物安(an)全通用要求》(GB19489-2008)。

　　1、嚴格執行各(ge)區功能劃分：

　　試劑(ji)儲(chu)存(cun)和準備(bei)(bei)區(qu)：貯(zhu)存(cun)試劑(ji)的(de)(de)制備(bei)(bei)、試劑(ji)的(de)(de)分裝和擴(kuo)增反(fan)應混合液(ye)的(de)(de)準備(bei)(bei)，以及離心管、吸頭等消(xiao)耗品的(de)(de)貯(zhu)存(cun)和準備(bei)(bei)。

　　標本(ben)(ben)制備區：核酸(RNA、DNA)提取、貯(zhu)存及(ji)其(qi)加入至(zhi)擴增(zeng)反(fan)應(ying)(ying)管。對于涉及(ji)臨床(chuang)樣本(ben)(ben)的操作(zuo)，應(ying)(ying)符合(he)生物安全二級實驗室(shi)防護設備、個人防護和操作(zuo)規范的要求。

　　擴(kuo)(kuo)增區：cDNA合成、DNA擴(kuo)(kuo)增及(ji)檢測。

　　擴(kuo)增(zeng)產物分析(xi)區：擴(kuo)增(zeng)片段(duan)的進(jin)一步分析(xi)測(ce)(ce)定，如雜交、酶切電泳、變性高(gao)效液(ye)相分析(xi)、測(ce)(ce)序等。

　　試劑(ji)準備(bei)區(qu)(qu)(qu)(qu)、樣(yang)本制備(bei)區(qu)(qu)(qu)(qu)和擴(kuo)增(zeng)區(qu)(qu)(qu)(qu)內的實驗用(yong)品，包括移液(ye)器等器具應專用(yong)，空氣、物品流向依次為：試劑(ji)準備(bei)區(qu)(qu)(qu)(qu)、樣(yang)本制備(bei)區(qu)(qu)(qu)(qu)、擴(kuo)增(zeng)區(qu)(qu)(qu)(qu)、產物分析區(qu)(qu)(qu)(qu)，不(bu)可逆行(xing)。

　　2、清(qing)潔的實(shi)驗用品：

　　實驗(yan)室(shi)自(zi)配試劑(去(qu)離(li)子水、緩沖液等)和所有使(shi)(shi)用(yong)(yong)(yong)器具在(zai)使(shi)(shi)用(yong)(yong)(yong)之前均應(ying)高壓滅菌或紫外殺菌。槍尖、反應(ying)管等實驗(yan)耗材應(ying)一次(ci)性(xing)使(shi)(shi)用(yong)(yong)(yong)。

　　3、正(zheng)確的實(shi)驗操作：

　　實驗應在超(chao)凈工作臺(tai)內進行，工作臺(tai)內應放(fang)置PCR專用(yong)的微量離心機、各量程的移液器和其(qi)他必需物品。

　　實(shi)驗的過程中選(xuan)擇最合(he)適尺寸的手(shou)套并(bing)能及時更(geng)換(huan)，在(zai)進(jin)出不同實(shi)驗區(qu)域或進(jin)行模板(ban)操作后都應更(geng)換(huan)實(shi)驗服、口(kou)罩、帽子(zi)及手(shou)套，以避免不同實(shi)驗區(qu)交叉污染。

　　裝有PCR試劑的反(fan)應管(guan)(guan)在打開(kai)之前應先瞬時離(li)心，將(jiang)管(guan)(guan)壁及管(guan)(guan)蓋上的液(ye)體(ti)離(li)至管(guan)(guan)底，降(jiang)低污染手套或(huo)加樣器的風(feng)險;謹慎開(kai)啟反(fan)應管(guan)(guan)，防(fang)止管(guan)(guan)內液(ye)體(ti)濺出或(huo)形(xing)成氣溶膠導致污染。

　　吸加試劑和(he)模板的操作(zuo)應嚴(yan)格按照規范(fan)要求進(jin)行，遵守“慢吸快打”原則，盡量(liang)一次性完成(cheng)，忌(ji)多(duo)次抽吸，以避(bi)免(mian)氣溶膠產(chan)生(sheng)的交(jiao)叉(cha)污染(ran)。

　　PCR試(shi)劑建(jian)議小量(liang)分(fen)裝(zhuang)，以(yi)減少反復凍融、重復取樣(yang)次數;多樣(yang)本(ben)(ben)PCR反應時，先配制反應混合液分(fen)裝(zhuang)至反應管中，最(zui)后加入樣(yang)本(ben)(ben)核酸，請勿(wu)同時開蓋，盡量(liang)保(bao)證單(dan)(dan)人單(dan)(dan)管，實現完(wan)全閉管操作。

　　實驗(yan)試劑應與樣品和PCR產物(wu)分開保存(cun)，不應放于同(tong)處。

　　PCR擴增實驗完成后(hou)及時將反應管取(qu)出，用一次(ci)性手套將產物反應管包(bao)裹丟棄(qi)，保證管蓋緊閉。

　　4、規范(fan)的實(shi)驗設(she)計(ji)：

　　應(ying)遵(zun)循實驗室(shi)內部質(zhi)量控制的相關規定，實驗中設立(li)陽(yang)性(xing)(xing)(xing)對照(zhao)、陰性(xing)(xing)(xing)對照(zhao)和(he)空白對照(zhao)，全(quan)程質(zhi)控實驗過程，驗證PCR反應(ying)的可(ke)靠性(xing)(xing)(xing)，并協助判斷擴(kuo)增系統的可(ke)信(xin)性(xing)(xing)(xing)。

　　PCR實驗室的污染應急處理方法

　　1、若核酸樣(yang)本溢出(chu)：

　　立即用布或紙巾覆蓋，由外圍向(xiang)中心傾倒10%的次氯(lv)酸(suan)消毒劑(ji)，約30分鐘(zhong)后，清除污染物(wu)品，再(zai)用次氯(lv)酸(suan)消毒劑(ji)擦拭，并用75%酒精噴(pen)灑(sa)，移動紫外車定點照射1小時。

　　2、其(qi)他不明情況(kuang)污染：

　　(1)暫停所(suo)有實驗操作;

　　(2)清理實(shi)驗室(shi)內所(suo)有物品，尋找污染(ran)來(lai)源;

　　(3)加大實(shi)驗室的通風;

　　(4)對實驗室內所有表面(臺(tai)面、地面及墻面) 進行消(xiao)毒;

　　(5)75%酒精空中噴霧(wu);

　　(6)開啟紫外(wai)消毒裝置，延長紫外(wai)照射時間(4小時以上(shang));

　　(7)以上措施每日進(jin)(jin)(jin)行(xing)，直至污(wu)(wu)(wu)染消除(chu);用新(xin)試劑及確認無污(wu)(wu)(wu)染的器材進(jin)(jin)(jin)行(xing)原污(wu)(wu)(wu)染項目(mu)的試劑空(kong)白檢測，連續(xu)3次(ci)均陰性后方可進(jin)(jin)(jin)行(xing)常規檢測。