檢驗方法(fa)驗證的(de)(de)基本內容包括(kuo)方案的(de)(de)起草及審批(pi)，檢測儀器的(de)(de)確認。

適(shi)用(yong)性驗(yan)證（包括準確度試(shi)驗(yan)、精(jing)密度測定、線性范(fan)圍(wei)試(shi)驗(yan)、專屬性試(shi)驗(yan)等）和結果評價及批準四個(ge)的方面。

首(shou)先是制定驗(yan)證方案，然后對大型精(jing)密(mi)儀器進行確認，最(zui)關鍵的(de)一步(bu)是檢驗(yan)方法(fa)的(de)適用性試驗(yan)，最(zui)后是檢驗(yan)方法(fa)評價及批準。

1、驗證方(fang)案(an)的制定

檢(jian)驗方法的(de)驗證方案通常由質量驗證小組提(ti)(ti)出(chu)。根據產品的(de)工藝條件、原輔料(liao)化學結構、中間體、分解產物(wu)查(cha)(cha)閱有關資料(liao)，提(ti)(ti)出(chu)規格標準，確定檢(jian)查(cha)(cha)項目，規定雜(za)質限(xian)度，即為質量標準草案。

根據質量標準草案確定檢查(cha)和(he)試驗范(fan)圍，對檢驗方(fang)法(fa)擬定具體(ti)(ti)操(cao)作步驟，最后經有關人(ren)員審批方(fang)可實施。

2、大型精密儀器(qi)的(de)確(que)認(ren)

分析測試中(zhong)所用的檢測儀器一般可分為三類：

A、普通儀(yi)器：崩解儀(yi)，折光儀(yi)、分(fen)析天(tian)平、酸(suan)度計(ji)、溶(rong)點測定(ding)儀(yi)、電導儀(yi)等;

B、較(jiao)精密儀(yi)(yi)(yi)器：旋光儀(yi)(yi)(yi)、永停滴定儀(yi)(yi)(yi)、費休氏水分測定儀(yi)(yi)(yi)、 自動滴定儀(yi)(yi)(yi)、藥物溶(rong)出度(du)儀(yi)(yi)(yi)、可見(jian)分光光度(du)計、電泳(yong)儀(yi)(yi)(yi)等；

C、大型精密儀器：紫外(wai)分(fen)光(guang)(guang)光(guang)(guang)度(du)計、紅外(wai)分(fen)光(guang)(guang)光(guang)(guang)度(du)計、氣相色譜儀、高(gao)效液相色譜儀、薄層掃描儀等。

為了保證分(fen)析測(ce)試數據準確可靠(kao)，每臺檢測(ce)儀器在投(tou)入正式使用之前(qian)都應進行確認。

檢(jian)測儀器的確認是檢(jian)驗(yan)方法驗(yan)證的基(ji)礎，應在其它驗(yan)證試驗(yan)開(kai)始之前首先(xian)完(wan)成。

檢測(ce)儀器確認工作內容應根據儀器類型。技(ji)術(shu)性能而定，通常包括：安裝(zhuang)確認、校正、適(shi)用性預試(shi)驗(yan)和再確認。

3、校正

校(xiao)(xiao)正是儀器確認及檢(jian)驗方(fang)法(fa)驗證(zheng)中的一(yi)個(ge)重要環節，應當(dang)在驗證(zheng)試驗以前進行(xing)校(xiao)(xiao)正。紫外分(fen)光光度(du)計(ji)校(xiao)(xiao)正包括波長校(xiao)(xiao)正、吸收度(du)測(ce)試、準確度(du)測(ce)試、雜散(san)光檢(jian)查(cha)。

氣(qi)相(xiang)色(se)譜儀與高效液相(xiang)色(se)譜儀均要求(qiu)做系(xi)統適用性試驗。在(zai)規定(ding)(ding)的色(se)譜條(tiao)件下測定(ding)(ding)色(se)譜柱的最小理(li)論塔板數(shu)。分離度和拖尾因子，并(bing)規定(ding)(ding)變異(yi)系(xi)數(shu)應不(bu)大(da)于2％。

對于(yu)化(hua)學檢驗(yan)中使用(yong)的計量儀器(qi)包括(kuo)容(rong)量瓶、移液(ye)管、滴定(ding)管、分(fen)析天(tian)平亦均應校正。

4、適用性預試驗

儀器的安裝確認(ren)完成以(yi)后(hou)，在其功(gong)能(neng)試驗符合(he)要求的情況下(xia)，應用(yong)(yong)標(biao)準(zhun)品或(huo)對(dui)照品對(dui)其進行(xing)適用(yong)(yong)性檢查，以(yi)確認(ren)儀器是否(fou)符合(he)使(shi)用(yong)(yong)要求。

例如對熔(rong)點(dian)測定儀的適用(yong)性預試(shi)(shi)(shi)驗是(shi)采用(yong)已知溶點(dian)的甲硝唑做試(shi)(shi)(shi)驗，測試(shi)(shi)(shi)結果與已知熔(rong)點(dian)比較。

紫外分光(guang)光(guang)度(du)計(ji)可(ke)用已(yi)知含量的某標準品試驗(yan)，測得結果(guo)與已(yi)知數值對比，確定儀(yi)器是否符合使用要(yao)求(qiu)。

在完成上述(shu)各項試驗工作的(de)同時，應做好相應的(de)文件記錄(lu)等資料歸檔工作，每一臺(tai)儀器均應有一套完整的(de)檔案資料。

5、再確認

為了(le)確(que)保儀器處于(yu)良好(hao)的使用(yong)狀態(tai)，對于(yu)一(yi)臺(tai)新購買的儀器在確(que)認工作結(jie)束以后(hou)，應根據儀器的類別。確(que)認的經驗制定再確(que)認的計劃。

再確(que)認的時間間隔和(he)(he)內容要根據儀器類別和(he)(he)使用情(qing)況決定(ding)，一般是3個月(yue)、6個月(yue)或1年。

儀器再(zai)確(que)認的(de)(de)內容通常包括(kuo)線路連接、附件備品消耗檢查、清潔工作(zuo)、功(gong)能(neng)試(shi)驗、工作(zuo)日記等，其中重點安裝確(que)認中的(de)(de)功(gong)能(neng)試(shi)驗。

藥品質量標(biao)準分析方法驗證的目的是(shi)證明采用的方法適合于相應的檢測要求。

在(zai)起(qi)草藥(yao)品質(zhi)量標(biao)準(zhun)(zhun)時，分析方(fang)法需經驗證：在(zai)藥(yao)物生產方(fang)法變(bian)更、制(zhi)劑的組分變(bian)更、原分析方(fang)法進(jin)行修訂時，則(ze)質(zhi)量標(biao)準(zhun)(zhun)分析方(fang)法也需進(jin)行驗證。

方法驗證過程(cheng)和(he)結果均應記載在藥(yao)品標準起草或(huo)修訂(ding)說明中。

根據《中國藥典》 附錄XIXA的原則要求，檢驗方法的驗證可分為三種情況處理；

1、無需驗證的方法。如藥典(包括USP、EP、CP、JP等各國藥典)的方法，一般只做系統適用性試驗，以確認系統是否符合要求(主要指儀器穩定性及柱的分離度是否達標)。

2、對比法。已在參比實驗室驗證過的分析方法，可用對比試驗的方法來確認方法的可靠性，即將本實驗室與參比實驗室用同一方法對同批樣品所測數據進行比較(如至少取五個批號，每批重復測定五次)，判斷方法在本實驗室的可行性。

如有(you)差(cha)異需查明原因或設計方案，對方法(fa)進行再驗證。

3、需進行系統驗證的方法。

安裝確認及適用(yong)性(xing)試驗(yan)(yan)結(jie)束后，應將試驗(yan)(yan)數(shu)據(ju)資料進行(xing)匯總分(fen)(fen)析。對(dui)檢驗(yan)(yan)方法作出(chu)正(zheng)確的(de)評價，驗(yan)(yan)證(zheng)報告的(de)說明及結(jie)論(lun)部分(fen)(fen)應簡(jian)明扼要。

試驗(yan)(yan)中的(de)主(zhu)要(yao)偏差應有適當解釋。然后，報主(zhu)管領導(dao)審批。檢驗(yan)(yan)方(fang)法驗(yan)(yan)證的(de)最終產物是一個經(jing)過(guo)驗(yan)(yan)證的(de)方(fang)法—根據驗(yan)(yan)證的(de)結(jie)果制(zhi)訂的(de)由有關領導(dao)批準(zhun)的(de)檢驗(yan)(yan)方(fang)法。

在如何正確或準確地估算檢出限的問題上,國際分析界一直存有爭議。檢出限的特殊意義在于可以對一個給定的分析方法在低濃度水平的檢測能力進行準確地評估，而考察一個分析方法在低濃度范圍的檢測性能，可以基于不同的角度或不同的側重點,如可以從最小信號值與儀器噪音之比來考察，從方法測定空白的平均波動性來統計估算,也可以根據分析方法校準曲線的偏差特性來定量估算等等。

檢出限是評價一個分析方法及測試儀器性能的重要指標,所謂“檢出”是指定性檢出，即判定樣品中存在有濃度高于空白的待測物質。

ACS(美國化學學會)對這一定義作了更簡明的概括:檢出限是一個分析方法能夠可靠地檢測出被分析物的最低濃度。

1、檢測(ce)限（limit of detection, LOD）定(ding)義:

在樣品中能檢出的被測組分的最低濃度（量）稱為檢測限，即產生信號（峰高）為基線噪音標準差k倍時的樣品濃度，一般為信噪比（S/N）2:1或3:1時的濃度，對其測定的準確度和精密度沒有確定的要求。目前，一般將檢測限定義為信噪比（S/N）3:1時的濃度。

2、計算公(gong)式為：

D=3N/S （1）

式中：N——噪音; S——檢測器靈敏度；D——檢測限

而靈敏度的計算公式(shi)為：

S=I/Q （2）

式中：S——靈敏度；I——信號響應值；Q——進樣量

將式（1）和式（2）合并，得到下式：

D=3N×Q/I (3)

式中：Q——進樣量；N——噪音；I——信號響應值。I/N即為該進樣量下的信噪比（S/N），該信噪比可通過工作站對圖譜進行自動分析獲得，一般的色譜或質譜工作站都可進行信噪比分析計算。這樣檢測限的計算方法就變得非常方便了。

3、計(ji)算(suan)方法(fa)：

實際計算時，檢出限有2種表示方法：一種是進樣瓶中樣品檢測限，一種是針對原始樣品的方法檢出限。

A、對第一種檢測限，只要知道進樣量和信噪比即可計算。如進樣瓶中樣品濃度為1 mg/L,在此濃度下的信噪比為300(由工作站分析獲得)，則其檢測限為：D =（3×1 mg L-1）/300 = 0.01 mg/L。也可用絕對進樣量表示，若進樣體積為10 ul，則其檢測限為：D = 3×（1 mgL-1×10 ul）/300 = 0.1 ng。

B、對第二種表示方法，需同時考慮原始樣品的取樣量和提取樣品的定容體積。仍按前述樣品計算，若取樣量為5克，最后定容體積為5 mL，則方法檢測限為：D = 0.01 mgL-1×5 mL/5 g = 0.01 mg/kg。

即當原始樣品中待檢物質的濃度為0.01mg/kg時，若取樣量為5g,樣品經前處理后定容體積為5mL時,進樣瓶中樣品的濃度可達0.01mg/L（假定回收率為100%）,此時，在其它給定的分析條件下，能產生3倍噪聲強度的信號。在實際檢測工作中，第二種表示方法更為常見。

4、注意事項(xiang)

由式（3）可見，信噪比的大小直接關系到檢測限的大小。信噪比計算方法的不同，其比值大小有很大不同，這與計算信噪比時基線噪聲峰值的定義方式有關，一般有三種不同的定義：

A、峰/峰（peak to peak）信噪比，用某一段基線噪聲的平均高度；

B、峰/半峰（half peak to peak）信噪比, 用某一段基線噪聲平均高度的1/2；

C、均方根（RMS）信噪比，用某一段基線噪聲的均方根值計算。

除此之外，信噪(zao)(zao)比的(de)計(ji)算結果還和所取(qu)噪(zao)(zao)聲(sheng)的(de)位置有(you)很大(da)關系(xi)，取(qu)信號哪一側(ce)(ce)基(ji)線的(de)噪(zao)(zao)聲(sheng)，取(qu)多長一段(duan)基(ji)線上的(de)噪(zao)(zao)聲(sheng)，計(ji)算結果都很不完(wan)全相(xiang)(xiang)同，有(you)時相(xiang)(xiang)差(cha)甚遠。一般多取(qu)樣品峰(feng)兩(liang)側(ce)(ce)的(de)噪(zao)(zao)聲(sheng)峰(feng)值計(ji)算。

5、檢(jian)出(chu)限(xian)的(de)確(que)定

A、《全球環境監測系統水監測操作指南》中規定：給定置信水平為95%時，樣品測定值與零濃度樣品的測定值有顯著性差異即為檢出限：

L = 4.6Sb

式中：L——方法的最低檢出濃度。

Sb ——測定次數為n次的空白平行測定（批內）標準差（重復測定20次以上）。

B、國際純粹和應用化學聯合會（IUPAC）規定對各種光學分析方法，可用下式計算：

L = KSb/S

L——方法的最低檢出濃度

Sb——空白多次測量的標準偏差（吸光度）；

S ——方法的靈敏度（即校準曲線的斜率）

為了評估 ，空白測定次數必須足夠多，最好能測20次。國際純粹和應用化學聯合會極力提倡取k值為3，一般來說，取 相應的置信水平大約為90%。

若 =0，并不意味著 ，或檢出限無限小。這時需配制一個濃度略大于零濃度的試樣系列（能產生一個可測信號值）代替全程序空白試驗，求出其標準偏差，用來代替 。

此外，有時為了工作方便和便于比較，也規定一個大家能接受的信號值作為檢出限，如分光光度法中，規定吸光度為0.010所對應的濃度即為檢出限L。

C、 美國EPA SW—846規定方法中的檢出限為：

L=3.143Sb

D、某些分光光度法是以吸光度（扣除空白）為0.010相對應的濃度值或絕對量為檢出限，這是一種實驗室間的協定方案。

E、氣相色譜法：檢測器恰能產生與噪音相區別的響應信號時所需進入色譜的物質最小量為檢出限，一般為噪音的二倍。

F、離子選擇電極法：當校準曲線的直線部分外延的延長線與通過空白電位且平行于濃度軸的直線相交時，其交點所對應的濃度值即為該離子色譜所對電極法的檢出限。

由測得的空白值計算出的L值不應大于分析方法規定的最低檢出濃度值，如大于方法規定值時，必須尋找原因降低空白值，重新測定計算至合格。

6、校正曲(qu)線繪制：

A、按分析方法步驟，通過實測濃度和儀器信號值的直線關系，確定實驗室條件下的測定上限。當測定上限低于方法的檢測上限時，只能用實測的直線范圍。

B、繪制校正曲線的分析步驟應與樣品分析相同，并且不少于5個濃度值。

C、校正曲線繪制與每批測定樣品同時進行，對某些分析方法的校正曲線的斜率穩定，批間誤差較小，使用原制校正曲線時，應與樣品同時測定2份中等濃度標樣和2份空白的平行樣。

測得標準的濃度（減去空白）值與原校正曲線相對應的濃度值的相對偏差，分光光度應小于5%；原子吸收法應小于10%，否則重新制作校正曲線。

最后還要(yao)(yao)(yao)特(te)(te)別(bie)強調，檢(jian)出限和測(ce)定(ding)下限是(shi)兩(liang)個(ge)(ge)不(bu)同(tong)(tong)的(de)(de)概(gai)念(nian)，它們是(shi)評價(jia)一(yi)個(ge)(ge)分(fen)析方(fang)法(fa)及測(ce)試儀(yi)器性(xing)能(neng)的(de)(de)重(zhong)要(yao)(yao)(yao)指標，檢(jian)出限是(shi)一(yi)個(ge)(ge)定(ding)性(xing)概(gai)念(nian)，而測(ce)定(ding)下限是(shi)一(yi)個(ge)(ge)定(ding)量(liang)概(gai)念(nian)，搞清楚(chu)兩(liang)者(zhe)概(gai)念(nian)和相互關(guan)系(xi)，可(ke)提高色譜分(fen)析中(zhong)檢(jian)測(ce)結果(guo)的(de)(de)準(zhun)確性(xing)和可(ke)靠性(xing)，特(te)(te)別(bie)在(zai)痕量(liang)分(fen)析中(zhong)，檢(jian)出限和測(ce)定(ding)下限的(de)(de)確定(ding)對(dui)于分(fen)析方(fang)法(fa)的(de)(de)選(xuan)擇具(ju)(ju)有(you)重(zhong)要(yao)(yao)(yao)意(yi)義(yi)，同(tong)(tong)樣的(de)(de)，對(dui)于實(shi)驗室質(zhi)量(liang)控制也具(ju)(ju)有(you)很重(zhong)要(yao)(yao)(yao)的(de)(de)意(yi)義(yi)。